牙齦卟啉單胞菌快速診斷方法研究進展

韓海芳，李智濤，鄭月月，梁夢歌，王 爍，高社干,2

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)屬于革蘭氏陰性球桿菌，在血平板上培養可與亞鐵血紅素結合形成黑色菌落，表面似金屬光澤，完全溶血。Pg有蛋白水解酶活性，分解色氨酸產生吲哚，無尿素酶和過氧化氫酶活性。Pg的毒力因子包括牙齦蛋白酶、莢膜、菌毛、血凝素、脂多糖、溶血素和鐵攝取轉運蛋白等，在細菌黏附和侵襲宿主細胞的過程中起著關鍵作用[1]。補體系統的失調、抗菌肽的降解和吞噬細胞功能的破壞能夠促進Pg的生存并導致其持續存在。Pg是牙周炎的主要病原體，能夠通過破壞牙齒周圍組織導致炎癥性疾病，最終可能導致牙齒脫落[2]。另外，Pg還與多種系統性疾病有關，如糖尿病、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、阿爾茲海默病和帕金森病等[3-4]。目前，已有大量文獻報道Pg與口腔及消化道癌癥也有一定的相關性，Pg可以促進食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的進展。這些由Pg引起的疾病威脅著人類的健康，給社會帶來了巨大的壓力，建立Pg的快速臨床檢測方法顯得至關重要。本文將主要從細菌學、免疫學、分子生物學以及新興技術等方面，對當前多種Pg檢測相關的研究進行綜述。

1 細菌學常規檢測方法

1.1 分離培養法

細菌檢測常用的方法為培養法，包括固體、液體和半固體培養等。根據不同種類細菌的生長要求，需要嚴格控制溫度、酸堿度、營養、厭氧環境等條件。Pg生長需要較高的營養條件，需要厭氧培養法來鑒定識別，在培養基中還需要添加氯化血紅素以及維生素K。使用固體培養基培養3 d后Pg可形成直徑約0.5～1.0 mm的白色菌落，突起于培養基表面，質硬且與培養基表面黏附較緊，7 d后菌落由白色變成黑色。

口腔中有大量的細菌，也可以采用共培養法培養多種細菌。從慢性牙周炎患者的齦下菌斑樣本中培養口腔細菌，在血瓊脂平板上生長的菌落表現出以下特征：Pg為微小的黑色、圓形、溶血性菌落；中間普氏菌呈褐色至黑色色素沉著、潮濕、不溶血的菌落；具核梭桿菌是微小的灰色、面包屑狀菌落；福賽斯坦納菌是微小的褐色、半透明和潮濕的菌落[5]。說明共培養方法可用于從口腔菌群中分離Pg。

培養細菌后可借助儀器觀察Pg更細微的形態結構，用藥后觀察Pg菌體情況。將Pg(ATCC 33277)實驗菌株接種于BHI血瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養48 h后觀察，Pg正常形態為邊緣光滑呈球桿狀，隨著黃芩質量的增加，Pg形態出現不規則變化，甚至出現菌體崩解現象[6]。肖曉蓉[7]在BHI培養基上研究了對氨基苯甲酸對Pg形態的影響，發現100 mg.L-1對氨基苯甲酸對Pg菌體影響較大，普遍出現明顯的變形，呈凹陷狀和不規則狀甚至崩解。可見，傳統的細菌分離培養方法在臨床細菌鑒定中具有不可或缺的重要作用，但檢測時間太長，很難達到快速鑒定的目標。

1.2 染色法

革蘭氏染色使用結晶紫或亞甲藍作為主要顏色，是微生物學中最重要的染色技術之一。根據革蘭氏染色和形態學差異，細菌可分為革蘭氏陽性球桿菌和革蘭氏陰性球桿菌。革蘭氏陰性細菌不吸收初級染色，因此在顯微鏡下呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。Pg屬于革蘭氏陰性桿菌。Noiri Y[8]為了研究Pg、直腸彎曲桿菌和黏稠放線菌的分布，取牙周炎周圍的牙周組織加工成連續切片，用 Brown & Brenn 修飾的革蘭氏染色法染色觀察到Pg主要存在于牙菌斑區域，特別是在淺袋和中袋區。革蘭染色也存在假陰性和假陽性。當然，染色步驟也在發生改進，目前有四步法、三步法和兩步法，但是，革蘭氏染色法仍然是目前臨床細菌學檢驗中最常用的檢測方法之一。

蘇木素伊紅染色法(HE染色法)是病理組織切片中使用最多的一種常規染色方法。堿性的蘇木素染液主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色，酸性染料伊紅主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色[9]。通過HE染色，發現Pg會導致組織發生炎癥反應。將Pg長期微量注入糖尿病大鼠肝臟，取肝臟組織切片，HE染色觀察組織病理學變化，發現Pg緩慢入血后肝臟內高遷移率族蛋白l表達異常升高，提示出現慢性炎癥反應[10]。為了誘導軟組織炎癥，在CD14 缺陷小鼠和正常小鼠局部注射牙齦卟啉單胞菌脂多糖，用HE染色軟組織后，測量奶酪樣壞死組織的表面積和淋巴細胞、中性粒細胞的數量，得出LPS脂多糖可與CD14受體結合，并誘導炎性細胞因子的表達[11]。雖然HE染色應用廣泛，但仍存在一定的局限性，染色結果易受溫度、時間、固定和脫水等因素的影響。

2 免疫學檢測方法

2.1 免疫酶測定法

2.1.1 酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)ELISA是一種根據抗原抗體反應從而達到檢測目的，以高特異性和高靈敏度為特點的檢測生物分子的免疫學方法[12]。有直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭法。直接法是將抗原或者抗體固定在載體上后加入抗體或者抗原最終形成抗原—抗體復合物，再加入底物顯色。間接法是將抗原固定在固相載體上，先加入待測抗體，后加入酶標抗體來實現對待測抗體的檢測。雙抗體夾心法是將抗體連接在固相載體上，洗滌后加入待測抗原，再加入酶標抗體，但抗原必須有兩個可結合部位，最后形成三明治結構[13]。競爭法是將特異性抗原致敏在載體上，加入待測抗體與酶標抗體進行競爭結合，經過孵育洗滌后加入底物顯色，待測抗體量與顯色深淺成反比。研究顯示：將Pg的牙齦蛋白酶制備單克隆抗體，通過ELISA測定法檢測Pg，測試結果與其它口腔細菌無交叉反應[14]，說明ELISA檢測方法可以用于檢測唾液中Pg。雖然ELISA方法不需要特別昂貴的試劑，但是操作時間較久，需要5 h左右，步驟也較繁瑣。

2.1.2 生物素親和素酶聯免疫吸附試驗(biotinavidin system-enzyme linked immunosorbent assay,BAS-ELISA)BAS-ELISA是一種廣泛應用的免疫酶放大系統，可應用到視覺膜免疫分析技術中，是用抗體檢測分析物并在膜上產生視覺可讀的靈敏且快速的檢測方法。把Pg的RgpB抗體預包被在硝酸纖維素膜上，捕獲Pg后加入生物素化的Kgp抗體，分析物被膜包被抗體和生物素化抗體以夾心形式捕獲。將生物素化抗體與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)結合，用 3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)底物顯色后出現藍色[15]。該技術不需要檢測設備，因為它可以用肉眼觀察，因此可用于制造經濟、快速的Pg檢測試劑盒。

2.1.3 免疫組化檢測法免疫組化是利用已知的特異性抗體與組織或細胞內的抗原結合,并利用酶作用于底物將所產生的顏色反應對抗原定位、定性、定量檢測的一種技術。目前已成為常規的病理學檢測技術，為病理診斷提供可靠的診斷依據。已有證據表明食管癌的發生和預后與Pg有顯著關系，可以通過免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶連結法(streptavidin-perosidase,SP)檢測ESCC組織中的Pg。我國學者馬立宇[16]采用免疫組織化SP法對ESCC患者的癌組織和癌旁組織進行染色，然后分析Pg蛋白表達，該方法在ESCC診斷及預后評估中有極高的應用價值。

2.2 免疫印跡檢測法(western blotting,WB)

WB已被廣泛應用于醫學研究領域，通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺(Sodium dodecyl sulfate polyAcrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠電泳將不同分子量的蛋白分離開來，然后再轉移到聚偏二氟乙烯(poiy vinylidene fluoride,PVDF)膜上，再用特異的單克隆抗體與蛋白質發生反應，從而對蛋白質進行定性及定量分析。為了檢測Pg菌毛蛋白(抗原)，可用Pg的單克隆抗體作為一抗，然后使用酶標二抗來檢測Pg單抗。另外，WB在Pg致病機制的研究中也扮演了重要角色，如將Pg注射到SD大鼠的尾靜脈，通過WB檢測海馬組織Tau蛋白的表達水平得出Pg可以使Tau蛋白過磷酸化，并促進炎癥的發生[17]。雖然WB方法對研究Pg至關重要，但是WB的實驗結果往往受制膠、上樣、轉膜和溫度等多方面影響。

2.3 免疫熒光檢測法

免疫熒光是用異硫氰酸熒光素或藻紅蛋白這兩種常用的熒光素來標記一抗或二抗，去檢測特異的抗原或抗體的方法，有直接熒光法和間接熒光法。研究顯示：在檢測Pg方面，間接免疫熒光比DNA探針和細菌培養檢測方法更加敏感[18]。另外，免疫熒光檢測法也可與流式細胞術(fluorescene-activated cell sorting,FACS)結合，使用針對Pg特異性脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)的單克隆抗體和異硫氰酸熒光素標記的二抗，通過FACS鑒定Pg，為快速篩選斑塊樣品中的細菌提供了新方法[19]。

2.4 免疫層析檢測法

免疫層析檢測法是臨床免疫學檢驗常用的方法之一。將抗體或抗原致敏在硝酸纖維素膜上，待測抗原或抗體通過毛細管作用與之發生反應，在免疫膠體金影響下產生顏色。該方法可用于檢測病毒、細菌、支原體和衣原體等。在檢測Pg方面，可用Pg的FimA蛋白制備單克隆抗體，分別把結合不同抗原位點的單抗作為金標抗體和捕獲抗體檢測Pg。該方法可以通過肉眼觀察結果，大大縮短了檢測的時間，成本低，適合臨床上大批量樣本檢測。

2.5 免疫磁珠分選法

隨著科技的進步，免疫學識別方式也越來越多樣化。免疫磁珠分選法是一個很好的選擇，不僅可以用來分選細胞，還可以結合抗體去檢測細菌。許多學者通過免疫磁珠分離法對Pg進行了大量的研究，例如：裴振華[20]將特異性抗體結合在免疫學磁珠上捕獲和分離Pg，通過觀察免疫磁分離前和分離后檢測樣本的阻抗變化來實現Pg特異性檢測。

3 分子生物學檢測方法

3.1 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)

PCR是一種擴增特定DNA片段的分子生物學技術，具有非常高靈敏度和特異性[21]。研究顯示：采用 PCR檢測方法檢測齦下菌斑中的Pg，其檢出率與牙周破壞的嚴重程度呈正相關[22]。不同的Pg菌株可能引起不同程度的牙周病。Kulkarni MR[23]使用異源雙鏈PCR來檢測不同嚴重程度的牙周炎病變中發現了Pg菌株的多樣性，PCR為分析Pg菌株多樣性提供了一種簡單準確的檢測方法。然而，當研究人類動脈粥樣硬化鈣化樣本時，Pg的 16SrRNA基因特定片段的擴增結果不佳，采用嵌套式 PCR 的方案可將Pg的檢測率提高了22.2%，具有良好的特異性[24]。PCR擴增往往存在假陰性、假陽性和非特異性擴增等問題，但是可以通過優化反應體系中各種參數和優化擴增條件來提高PCR方法的敏感性和特異性。

3.2 熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)

qPCR技術具有操作簡便、靈敏度高和特異性強等特點，在醫學、生物學和病理學等領域均有廣泛的應用[25]。很多學者用qPCR來檢測Pg，例如Gu BL[26]使用Tris-EDTA緩沖液處理樣品后直接 qPCR(TE-direct qPCR)進行測試，并與常規PCR進行對比，結果顯示 TE-direct qPCR 檢測是一種簡單有效的口腔Pg定量方法，并且顯示出較高的靈敏度和特異性。另外，研究顯示qPCR比PCR能更加敏感地檢測出牙周病患者Pg的16S rRNA[27]。可見，qPCR 是一種靈敏特異的 DNA 擴增技術，在檢測Pg方面具有良好的應用前景。

3.3 環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

LAMP是一種用于檢測目標 DNA 和 RNA 的通用技術，可使用最少的設備進行快速分子診斷。LAMP需要4種引物和1種DNA聚合酶在等溫條件下高效率和高特異性地進行擴增。LAMP檢測技術已經應用于臨床牙周病原體的檢測，特別是Pg的快速檢測，其檢測結果與常規PCR檢測的結果基本一致[28]。隨后，分子信標-Loop介導的等溫擴增，被稱為MB-LAMP，用于檢測特定DNA片段的Pg。這種方法為Pg的即時檢測提供了巨大的便利。MB-LAMP 的檢測速度明顯快于qPCR，減少了臨床診斷所需的時間[29]。

4 其它新興技術

4.1 納米技術檢測

納米技術是一場新的技術革命，具有高性能、多功能、縮微化、成本低和環境友好等特點，該技術推動了生物化學、微電子技術、物理化學和材料學等多個領域的發展[30]。納米技術與免疫學技術相結合加快了細菌檢測的速度與靈敏度。牙齦蛋白酶(gingipain)是Pg特異性蛋白酶，將牙齦蛋白酶特異性肽底物標記磁性納米珠，金色變成黑色，當樣品中有Pg時金色再次出現，由此對Pg進行快速檢測[31]。邸小建[32]通過溶膠凝膠法制備上述轉換熒光納米微球，經表面改性后結合Pg抗體，用直接免疫法與Pg進行反應，結果顯示結合抗體的納米顆粒能夠與Pg特異性地結合，提示該方法是一種潛在的Pg檢測方法。

4.2 表面增強拉曼光譜( surface-enhanced raman scattering ,SERS)檢測

SERS是一種能將待測目標物的信號強烈放大的技術。納米結構通常由SERS活性金屬制成，例如銀、金、銅或它們的合金。原因是它們具有覆蓋大部分可見光和近紅外波段的局域等離子共振(localized surface plasmon resonance, LSPR)。SERS技術通過電磁和化學兩種機制放大信號，以其高水平的靈敏度和特異性而聞名。已經證明SERS 可用于識別和檢測各種細菌菌株。將鍍銀磁性納米粒子吸附Pg后加到Si/Ag SERS平臺上，記錄SERS光譜即可快速檢測Pg[33]。這項研究對于快速診斷非常有幫助，有助于開發適當的治療藥物以預防牙周炎。

4.3 質譜檢測

近年來質譜技術與熒光成像技術相結合在生物醫學檢測中得到廣泛應用，內源性熒光團被紫外光照射并發出可見光，這種熒光特性可用于檢測牙菌斑,可以基于光誘導自發熒光光譜鑒定細菌。在405 nm激發下的Pg熒光光譜在約500 nm處有一個負值谷，約635 nm 處有一個峰，在約705 nm 處有第二個峰，由此可以對細菌分類，檢測的敏感性和特異性可達到99%[34]。在Pg中可以檢測到原卟啉IX，然而原卟啉的熒光光譜和Pg的熒光光譜一致，猜想Pg的熒光光譜可能歸因于原卟啉IX和糞卟啉[35]。

5 總結

目前，Pg被認為是參與牙周病發病和疾病進展的關鍵病原體，在食管癌特別是ESCC的發生和發展過程中起著重要的作用。因此，建立快速準確的Pg檢測方法顯得尤為重要和迫切。當前的Pg檢測方法均有一定的局限性，希望本文能夠為以后探索Pg檢測方法提供參考。