西瓜種子EMS誘變技術(shù)

申賽亞，曾紅霞，任 儉，柴姍姍，孫玉宏，張 娜

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，武漢 430345；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018）

西瓜（CitrulluslanatusL.）作為世界性的園藝作物，營養(yǎng)價值十分豐富，受到人們廣泛喜愛。但其自身抵抗生物脅迫和非生物脅迫能力脆弱，很大程度上制約了品質(zhì)和產(chǎn)量的提高［1］。且育種學(xué)家長期帶有偏好性的選育造成一些性狀丟失使得西瓜多樣化育種進展緩慢，難以實現(xiàn)育種效率的突破，而借助誘變技術(shù)創(chuàng)建飽滿突變體庫可為西瓜育種提供嶄新的種質(zhì)資源，推動種質(zhì)創(chuàng)新，有效打破當前西瓜育種工作所面臨的現(xiàn)狀［1，2］。

誘變技術(shù)包括物理誘變［3］、化學(xué)誘變［4-6］、生物誘變和空間誘變［5］等。其中，化學(xué)誘變技術(shù)具有操作簡便、價格低廉、誘變劑量容易控制且對基因組損傷小、突變頻率高、突變范圍廣、時間周期短的特點，在多種作物中均有應(yīng)用［7-15］，已成為近年來運用最為廣泛的誘變技術(shù)，產(chǎn)生了較大的經(jīng)濟效益和社會效益［16-18］。甲基磺酸乙酯（EMS）是應(yīng)用最多、效果最為明顯的化學(xué)誘變劑［2，15，19-22］，具有高效穩(wěn)定、易點突變、染色體畸變頻率低、誘變效果好及可針對性改良某種特殊性狀等優(yōu)勢，在多種作物中均有應(yīng)用，如水稻［23-25］、玉米［26］、白菜［27］、茄子［28］、甜瓜［29］、番茄［30，31］等。經(jīng)過EMS誘導(dǎo)后的突變體庫對于功能基因研究具有重要意義［7，32，33］。種子作為最常見的誘變材料具有操作簡便、對操作環(huán)境要求不高、無需無菌操作、工作量小并在誘變后變異性狀經(jīng)幾代積累后可長期穩(wěn)定遺傳的優(yōu)點，便于大批量誘變研究［15，21，34］。相比于其他作物，西瓜利用EMS構(gòu)建突變體庫起步較晚，2015年朱娜娜［1］研究發(fā)現(xiàn)1.0%濃度下誘導(dǎo)9 h為西瓜W1-17種子的最佳誘變條件，之后通過觀察M1代、M2代的農(nóng)藝性狀，構(gòu)建出具有48種變異類型的突變體庫。明確EMS最佳處理條件是進行誘變育種研究的關(guān)鍵，公認的最佳誘變劑量是經(jīng)誘變處理后植株存活50%的半致死劑量，可在保證產(chǎn)生較大變異的基礎(chǔ)上不過大損傷誘變材料從而達到良好的誘變效果［35］，并且研究表明誘變濃度、誘變時間及誘變材料等因素對誘變效率均會產(chǎn)生不同程度的影響［12，35-38］。

本研究以武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院西甜瓜研究室供給的高代自交西瓜‘97103’為研究對象，利用EMS對其種子進行誘變處理，分析其西瓜發(fā)芽率、成苗率，進而獲得西瓜種子誘變的適宜處理組合，為西瓜種質(zhì)資源的創(chuàng)新提供種質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為高代自交的西瓜‘97103’種子，由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院西甜瓜研究室供給。該西瓜品種特點有花皮、中果、果肉紅、肉質(zhì)酥脆，適應(yīng)性強。

EMS試劑購自Sigma公司，為無色溶液，微溶于水。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 用KH2PO4和K2HPO4·3H2O配制成pH為7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖溶液后，將EMS誘變劑稀釋成不同濃度，Na2S2O3為誘變終止劑和解毒劑。

1.2.2 EMS誘變處理 試驗共設(shè)置18個誘變處理組合，每處理50粒種子，3次重復(fù)。在通風(fēng)櫥中使用25 mL EMS試劑浸種，共設(shè)置6個EMS濃度梯度（0%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%），以磷酸緩沖液浸泡種子作為對照，標記為0，將各組種子分別置于28℃、90 r/min搖床上避光振蕩誘導(dǎo)4、8、12 h。誘變完成后倒掉誘變劑，用Na2S2O3溶液進行解毒處理：加入配制好的25 mL 1 mol/L Na2S2O3溶液，混勻后棄去；然后加入25 mL 100 mmol/L的Na2S2O3溶液，混勻5 min后棄去溶液，再用100 mmol/L Na2S2O3溶液沖洗種子3遍；注入25 mL去離子水混勻5 min后，棄去溶液，去離子水反復(fù)沖洗種子3次；最后用流水沖洗種子2 h后進行發(fā)芽培養(yǎng)。

結(jié)合發(fā)芽、成苗的半致死率來確定最佳誘變組合。

1.2.3 催芽方法和發(fā)芽率測定 采用培養(yǎng)皿濾紙法進行發(fā)芽試驗，將誘導(dǎo)后的種子置于有吸水紙的培養(yǎng)皿中，微微潤濕，種子上附一層遮光紙，28℃的恒溫箱催芽，觀察記錄發(fā)芽情況。當種子露白2 mm時記作發(fā)芽，共計催芽7 d（當天發(fā)芽的種子需當天播種），每天統(tǒng)計各處理發(fā)芽數(shù)，計算發(fā)芽率。

發(fā)芽率=（種子總發(fā)芽數(shù)量/供試種子數(shù)量）×100% （1）

1.2.4 出苗率和成苗率的測定 播種于70孔的育苗穴盤中，每天早上觀察記錄種子出苗情況。子葉露出土層1.5 cm記作萌發(fā)，兩葉一心作為成苗依據(jù)，于30 d時統(tǒng)計各處理成苗數(shù)，計算成苗率。

成苗率=（成活苗總數(shù)/供試種子數(shù)）×100%（2）

本試驗將經(jīng)過最佳誘變處理后的種子長至兩葉一心時進行定植，觀察記錄西瓜植株的全生育期性狀，2021年5月進行自花授粉，6月單瓜收種。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。采用Excel、Origin 2019 b軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同EMS誘變處理對西瓜種子發(fā)芽率的影響

由圖1、表1可知，1.5%和2.0%濃度處理下的發(fā)芽率變動幅度較小，而當EMS誘導(dǎo)濃度超過3.0%時，發(fā)芽率下降趨勢增強。5.0%濃度處理4 h的發(fā)芽率為90%，相較于0濃度處理下的4 h發(fā)芽率降低了10.00個百分點；而相同5.0%濃度處理12 h的發(fā)芽率僅51.33%，相較于4 h的5.0%濃度降低了38.67個百分點，相較于0濃度下處理4 h的發(fā)芽率降低了48.67個百分點。說明誘變時間越長發(fā)芽抑制效果越明顯。

圖1 EMS不同濃度對西瓜‘97103’種子發(fā)芽率的影響

由圖2和表1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著處理濃度的增大，西瓜種子發(fā)芽率下降趨勢明顯。其中，不同誘變濃度誘導(dǎo)4 h，整體發(fā)芽率下降幅度較小，5.0%濃度處理下的發(fā)芽率較0濃度處理降低了10.00個百分點；而當誘導(dǎo)時間超過8 h時，不同誘導(dǎo)濃度處理下發(fā)芽率下降較快，其中，1.5%濃度處理8 h時發(fā)芽率為99.33%，而5.0%濃度處理8 h發(fā)芽率下降至60.67%，較處理4 h降低了29.33個百分點，相較于0濃度處理8 h降低了38.66個百分點。表明在一定范圍內(nèi)，隨著EMS處理濃度的增大，西瓜種子發(fā)芽所受的制約作用增強。

表1 不同EMS處理對西瓜種子‘97103’發(fā)芽率的影響（單位：%）

圖2 不同EMS誘變時間對西瓜‘97103’種子發(fā)芽率的影響

綜上可知，隨著EMS誘變處理時間的延長，誘變濃度的增大，西瓜種子發(fā)芽率下降趨勢明顯。誘變濃度愈大及誘變時間愈長，對西瓜種子發(fā)芽抑制作用越強。

2.2 不同EMS誘變處理對西瓜種子成苗率的影響

由表2可知，當誘變時間為12 h時，誘變濃度5.0%的成苗率相較于1.5%濃度顯著降低49.33個百分點。隨著誘變時間的延長，EMS誘變對西瓜種子成苗的抑制效果更加明顯。在5.0%誘變濃度下，隨著誘導(dǎo)時間從4 h增至12 h，西瓜種子成苗率降低了45.33個百分點。

由圖3和表2可知，1.5%和2.0%濃度處理下的成苗率變動幅度較小，而當EMS誘變濃度達到或超過3.0%時，成苗率下降趨勢明顯。5.0%濃度處理8 h成苗率為53.33%，接近半致死數(shù)，而當相同處理濃度下處理12 h成苗率跌至40.67%，遠超出半致死數(shù)。說明在一定濃度范圍內(nèi)，隨著處理時間的延長，EMS誘變對西瓜種子成苗的抑制作用增強。

圖3 不同EMS誘變時間對西瓜‘97103’種子成苗率的影響

由圖4和表2可知，不同誘變濃度誘變4 h，整體成苗率下降較緩，5.0%濃度處理下的成苗率較對照僅降低了13.33個百分點。而當誘變時間超過8 h時，不同誘導(dǎo)濃度下成苗率下降較快，其中，2.0%濃度下處理12 h成苗率為88.00%，而5.0%濃度處理下成苗率下降至40.67%，降低了47.33個百分點。可見，在一定范圍內(nèi)，隨著處理濃度的增大，EMS誘變對西瓜種子成苗的抑制作用增強。

圖4 不同EMS誘變濃度對西瓜‘97103’種子成苗率的影響

表2 不同EMS處理對西瓜種子‘97103’成苗率的影響（單位：%）

綜上所述，隨著EMS誘變濃度的增大，處理時間的延長，西瓜種子成苗率呈下降趨勢。EMS誘變濃度愈大及誘變時間愈長，對西瓜種子成苗的抑制作用越強。

3 小結(jié)

EMS作為主流的化學(xué)誘變劑，具有誘變頻率高、誘變效率好、誘變范圍廣、易產(chǎn)生點突變、染色體畸變少等特點，較常見的誘變材料有種子［32］、花粉［26，39］、葉片［40，41］、莖段［16，42］、愈傷組織［20］、叢生芽［43］等。種子具有其他材料不可比擬的優(yōu)勢：第一，其操作簡便、無需大型儀器［21］；第二，相對于運用組織培養(yǎng)的方式而言，誘變?nèi)~片、莖段、愈傷、叢生芽對操作環(huán)境要求低，無需無菌操作；第三，經(jīng)誘變后變異性狀經(jīng)幾代積累后能長期穩(wěn)定遺傳，可進行大批量誘變研究。故本研究以‘97103’種子為研究材料進行EMS誘變處理。

EMS誘變育種的目的是獲得變異材料進行種質(zhì)創(chuàng)新，因此確定最佳的誘變條件至關(guān)重要。這就需要盡可能在保證產(chǎn)生較大變異的基礎(chǔ)上又不過大損傷誘變材料從而保證產(chǎn)生足夠的誘變率和成活率，現(xiàn)廣為認可的最佳誘變條件是經(jīng)誘變處理后存活50%的半致死劑量。關(guān)于存活的定義出現(xiàn)多種理解，其中，宋燕妮［37］、程蛟文等［36］、尚娜［44］采用發(fā)芽率作為分析指標，但這不能保證一定的存活株數(shù)，無法產(chǎn)生足夠大的突變?nèi)后w。王春霞等［45］、王學(xué)征等［2］、薛紅霞等［46］以成苗率作為半致死劑量指標構(gòu)建了突變?nèi)后w。考慮到以上因素本研究在關(guān)注發(fā)芽率的同時也關(guān)注成苗率，并以兩葉一心作為成苗標準，以此確定最佳誘變條件，進而保證一定的誘變率和成活率。

本試驗通過設(shè)置18個誘變組合（3個時間，6個濃度梯度）處理西瓜‘97103’種子，統(tǒng)計分析不同處理條件下西瓜種子的發(fā)芽率及成苗率，發(fā)現(xiàn)5.0%的EMS處理8 h的發(fā)芽率、成苗率接近半致死劑量，從而明確了西瓜‘97103’種子誘變的理想條件是5.0%的EMS處理8 h。而現(xiàn)有的構(gòu)建西瓜突變體庫的研究中，EMS最佳誘變劑量均小于2.5%。除受種子開殼與否、浸種時間的因素影響外，也可能與西瓜‘97103’種子本身具有較強的EMS耐受性有關(guān)。前人研究認為EMS濃度和誘變時間皆會對發(fā)芽率、成苗率產(chǎn)生影響，濃度越高、處理時間越長下降愈顯著［45］，本研究得出相同結(jié)論。將誘變后的植株進行全生育期的觀察，可以看到皺縮葉、葉緣變圓、縮小葉、葉色變藍、葉變狹長、畸形葉、嵌合體、節(jié)間縮短等多種類型突變體。隨著測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，西瓜全基因組學(xué)研究已進入后基因組學(xué)時代。通過西瓜突變體庫的構(gòu)建與測序技術(shù)的結(jié)合可明確突變基因及功能，有助于西瓜分子育種及進行相關(guān)農(nóng)藝性狀基因分子機制的研究。本研究結(jié)果為構(gòu)建西瓜突變體庫及西瓜相關(guān)功能基因組學(xué)研究提供了材料基礎(chǔ)。