CRISPR-Cas9技術介導蔬菜作物遺傳改良研究進展

萬麗麗，王轉茸，湯 謐，張學軍，曾紅霞，任 儉，張 娜，孫玉宏，熊建順，朱志坤

（1.武漢市農業科學院，武漢 430065；2.新疆農業科學院哈密瓜研究中心，烏魯木齊 830091；3.新疆農業科學院海南三亞農作物育種試驗中心，海南 三亞 572014；4.武漢市蔡甸區農業農村局，武漢 430199）

蔬菜作物富含纖維、維生素、微量元素、抗氧化劑及礦物質等重要營養，是人類合理膳食中不可或缺的重要來源。然而氣候環境的變化帶來的病蟲害、缺素以及干旱、鹽堿、漬害等對蔬菜生產及供應造成潛在的風險［1，2］，迫切需要育種者從高產、穩產、營養品質以及生物和非生物脅迫抗性等方面選育新品種以適應生產及市場需求。農作物品種的選育經歷了馴化育種和雜交育種等常規育種階段并選育得到具有適應性的優良品種。隨著長期的人工選擇，常規育種的缺點不斷凸顯，主要表現在過于依賴自然等位基因的變異使得可利用的遺傳種質資源狹窄；改良目標性狀的同時由于連鎖累贅效應帶來眾多不利性狀，嚴重降低育種效率［3］。新興農作物生物技術的開發及應用為高效率精準的品種選育提供了技術支撐。序列特異性核酸酶（SSNs）如鋅指核酸酶（ZFNs），轉錄激活類效應核酸酶（TALENs）和CRISPR-Cas基因編輯技術能夠在特定DNA位點產生雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）。在真核生物中，DSBs的修復機制主要有2種：①非同源末端連接（Non homologous end joining，NHEJ），在沒有同源修復模板時，NHEJ修復能夠使斷裂染色體發生不準確的連接，斷裂的位置一般會通過修復而出現少量堿基的缺失或插入，實現基因敲除；②同源重組修復（Homology directed repair，HDR），在存在同源序列情況下，HDR能夠以其為修復模板，使同源序列能夠精確定點地替換或者插入相應的剪切位點［4］。雖然ZFNs和TALEN技術已經應用并獲得了農作物基因編輯的產品，但是構建過程繁瑣且花費昂貴，限制了技術的廣泛應用［5，6］。CRISPR-Cas基因編輯技術是近年發展起來的，以其操作簡單、準確高效的優勢成功地應用到農作物的遺傳改良中。

根據Cas編碼基因的核心序列差異，CRISPRCas系統分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3種不同類型，其中Ⅰ型和Ⅲ型系統需要多個Cas蛋白形成復合體才具有完整的剪切活性［7］。Ⅱ型系統相對簡單，除crRNA和tracrRNA以外，僅需要一個Cas9蛋白就可以完成對特定外源DNA的切割，Cas9蛋白由RuvC結構域和HNH核酸結構域組成，分別對目標外源DNA雙鏈中的一條行使切割功能［8］。目前常用的CRISPR-Cas9系統就是在Ⅱ型的基礎上改造獲得，該系統具有一條引導作用的sgRNA（single-guide RNA）和一個Cas9蛋白。其中sgRNA由一段與靶基因同源配對的20 bp RNA片段（crRNA）和一段60 bp的RNA片段（tracrRNA）組成。CRISPR array轉錄成為前體RNA轉錄本（precursor RNA transcript，pre-crRNA）。一個非編碼的反式激活CRISPR RNA（crRNA）與前體RNA轉錄本雜交，與Cas9蛋白相結合，加工得到成熟的crRNAs。實際操作是將sgRNA序列和Cas9編碼基因重組質粒導入受體細胞，在sgRNA引導下，Cas9蛋白靶向切割目標雙鏈DNA，形成DSBs，繼而根據DNA修復的方式得到基因失活或者基因獲得的突變表型。

1 CRISPR-Cas基因編輯系統

1.1 常用的CRISPR-Cas類型

來自化膿鏈球菌的SpCas9是常用的Ⅱ型CRISPR-Cas系統的關鍵核酸酶，在sgRNAs作用下識別PAM序列，結合靶位點的互補序列，切割雙鏈DNA，在PAM上游3 bp處產生雙鏈斷裂［9］。為了拓展Sp-Cas9識別不同PAM序列，開發出SpCas9變體如識別5′-NG、5′-GAA和5′-GAT［10］，金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Cas9）SaCas9識 別5′-NNGRRT［11］，嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus，Cas9）StCas9識別5′-NNAGAAW［12］，腦膜炎雙球菌（Neisseria meningitidis，Cas9）NmCas9識 別 5′-NNNNGATT［13］，空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，Cas9）CjCas9識別5′-NNNVRYM［14］，CasX或Cas12e識 別5′-TTCN［15］。type VI CRISPR-Cas系 統 中Cas13（C2c2）蛋白介導高效干擾靶向RNA病毒應用到植物抗病毒研究中［16］。

1.2 單堿基編輯系統

單核苷酸突變是農作物中許多重要農藝性狀發生變異的遺傳基礎，單堿基的變異會導致氨基酸替換或者蛋白質翻譯終止，使得基因功能發生改變，從而獲得優良的等位基因與優異性狀。CRISPR技術衍生的單堿基編輯工具能夠高效實現基因組中靶序列編輯活性窗口內C＞T或A＞G的轉變。單堿基編輯系統能夠在不產生雙鏈斷裂的前提下，將nCas9和胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）、尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）構成的胞嘧啶單堿基編輯器（CBEs）、nCas9切口酶和腺嘌呤脫氨酶融合的堿基編輯器（ABEs）以及雙堿基編輯器（Dual base editing technology），由起導航作用的gRNA引導至靶位點發揮堿基替換作用，分別能夠對目標位點實現高效胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）到鳥嘌呤（G）以及實現C-G到T-A和A-T到G-C的同時突變［17，18］。

1.3 引導編輯（Prime editing，PE）

引導編輯系統是由向導RNA（prime editing guide RNA，pegRNA）Cas9核酸切口酶（Cas9 nickase，H840A）和逆轉錄酶組成。原理是Cas9切口酶在pegRNA上的sgRNA指引下，切割DNA單鏈，形成3′末端（3′flaps）和5′末端（5′flaps）兩段序列，而5′末端會被具有5′核酸外切酶活性FEN1和具有5′核酸外切酶活性的EXO1蛋白切割。而3′末端通過反轉錄pegRNA 3′-端的PBS（引物結合序列Primer binding site，PBS）可以與切割斷點前的互補序列識別配對，逆轉錄酶（M-MLV RT）以pegRNA上PBS序列后的人工設計序列為模板進行逆轉錄，將目標序列直接聚合到切口的DNA鏈上［19］（圖1）。目前PE系統在植物里處于起步階段，能夠在不引入雙鏈斷裂DSB和供體DNA模板的前提下實現靶標位點的插入、缺失和所有12種類型點突變［20］。為了提高PE系統的適用性，研發人員認為可以優化pegRNA參數包括PBS和RT模板的長度，以促進非編輯鏈切口形成；優化植物載體的元件如啟動子、核定位信號等以利于PE系統的高效轉化利用；將現在常用的雙啟動子系統簡化為緊湊的單轉錄單元（Single transcript unit，STU），利用一個啟動子啟動用于精確編輯的多基因如nCas-M-MLV-RT融合蛋白、pegRNA和切割非編輯鏈的sgRNA表達框；利用直接轉運到細胞內部的核糖核蛋白復合體（Ribonucleoprotein complex，RNP）提高PE高效基因編輯；利用多樣化的Cas切口酶（SpCas9-NG、ScCas9、SaCas9等）擴展PAM區類型，增加PE在植物中應用的可塑性［21，22］。

圖1 Prime editing引導編輯系統構成與作用機理

2 CRISPR-Cas基因編輯系統在植物中的遞送

CRISPR基因編輯技術在植物應用中面臨的技術瓶頸是如何順利地將編輯元件導入植物細胞中。常用的遞送方法有利用基因槍、農桿菌介導的組織培養、PEG介導原生質體轉化［23］。目前最常用的方法是利用農桿菌介導的方式將CRISPR-Cas等序列特異性核酸酶和選擇標記表達框導入受體植物細胞，在選擇性培養基中再生獲得穩定整合的轉基因植株。然而以質粒為基礎的遞送方法會因為植物種類或者基因型的愈傷組織誘導和再生效率極低，限制了此技術的應用。因此發展無需轉化的CRISPR-Cas高效遞送方法，建立DNA-free植物基因編輯技術，有助于加速作物育種進程、降低監管成本、推動基因編輯作物的產業化應用。利用CRISPRCas9核糖核蛋白復合物（RNPs）轉化原生質體獲得DNA-free的研究已在擬南芥、煙草、生菜、水稻、玉米和小麥等作物上成功實現［24-26］，但是PEG轉化細胞后再生過程長且獲得完整植株難度大。基因槍法雖然能夠將T-DNA轉化到植物細胞中，但是轉化效率低，容易產生染色體斷裂繼而導致DNA重組的發生［27］。T-DNA表達載體也可以通過PEG介導或者電轉化法實現原生質體轉化，但是轉化效率和再生效率非常低，限制了該技術的應用。病毒載體系統是外源基因體內遞送和瞬時表達的理想工具，是轉基因穩定表達系統的重要補充。在植物領域應用中，盡管植物病毒表達系統廣受關注，但是CRISPR-Cas核酸酶包括轉錄順式元件達5～6 kb時，遠超出已知大多數植物病毒載體1～2 kb的包容極限。因此，大多數研究者只能在Cas9超表達的植株中利用各種病毒如煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）［28，29］、煙 草 花 葉 病 毒（Tobacco mosaic virus，TMV）［30］、豌豆早褐病毒（Pea early-browning virus，PEBV）［28］、大麥條紋花葉病毒（Barely stripe mosaic virus，BSMV）［31］、狐尾草花葉病毒（Foxtail mosaic virus，FoMV）［32］、甜菜叢根病毒（Beet necrotic yellow vein virus，BNYVV）［33］和單鏈DNA白菜卷葉病毒（Cabbage leaf curl virus，CLCV）［34］介導sgRNAs的傳遞并獲得基因編輯的組織或植株。由于大多數植物不同基因型的轉化再生效率存在差異，因此一種不通過組織培養的新型gRNA和Cas9傳遞系統對農作物基因編輯育種至關重要。2020年浙江大學李正和團隊表達出一種工程化的植物負鏈RNA（NSR）病毒，將CRISPR-Cas9表達框插入植物細胞質彈狀病毒大麥黃條紋花葉病毒（Barely yellow striate mosaic virus，BYSMV）和苦苣菜黃網彈狀病毒（Sonchus yellow net rhabdovirus，SYNV）載體，并在gRNA序列兩側連接tRNAGly前體序列，在細胞內源tRNA加工機制下對病毒轉錄的gRNA末端進行精確剪切；當重組病毒接種本氏煙時能有效形成系統侵染并表達Cas9/gRNA分子，產生可高達90%的靶向編輯。由于該重組載體可以通過汁液摩擦傳代，維持了CRISPR-Cas9穩定表達和高效編輯；研究中發現該彈狀病毒通過成比例地擴展毒粒子的長度來包容病毒基因組中較大外源基因片段的插入，為Cas9在基因組的穩定性和載體承載能力提供了一種可能［35］。

此外，Lei等［36］將CRISPR-Cas9系統直接轉化花粉母細胞獲得再生植株。Daniel F.Voytas團隊利用植物分生組織重要的發育調控因子（Development regulators，DRs）包 括WUSCHEL（WUS）、SHOOT MERISTEMLESS（STM）、ipt的不同組合，誘導分生組織產生莖及小葉，進而生根培養，促使芽狀增殖體形成穩定傳代的轉基因植株；之后將Cas9轉基因煙草地上分生組織全部去除后，用含有DRs和PDS sgRNA表達單元的農桿菌注射切口部位，最終獲得可以穩定遺傳的基因編輯后代，并在部分基因編輯后代中已經檢測不到外源轉基因插入［37］。上述研究成果可以為不依賴于組織培養的基因編輯技術應用提供技術支撐。

如圖2所示，組裝的CRISPR-Cas9 RNPs通過PEG介導方法轉化原生質體。包含CRISPR-Cas組件的T-DNA通過農桿菌介導方法轉化到植物細胞（外植體如子葉、下胚軸；小孢子細胞以及完整植株體），最后原生質體或者組織再生成基因編輯植株。在病毒誘導的基因編輯系統中，sgRNA與RNA移動元件整合到煙草環斑病毒（TRV）RNA2，將TRV RNA1和TRV RNA2轉化農桿菌注射到Cas9超表達的植株，sgRNAs表達后在組織中傳遞靶向突變目標基因。通過denovomeristem誘導系統驗證，去除Cas9超表達植株分生組織后，將表達形態建成調控因子（MRs）和sgRNA表達的載體注射到剪枝的位置。MRs能夠誘導基因編輯分生組織從頭形成，最后從發育的芽再生得到基因編輯植株。

圖2 CRISPR-Cas9系統遞送到植物的方法

3 CRISPR-Cas9在蔬菜作物中的應用

目前CRISPR-Cas9已經在主要糧食作物中應用，解決了產量提升、品質改良和抗性增強等育種資源匱乏的難題。隨著50多種蔬菜作物全基因組測序的實現，一些重要表型和農藝性狀如抗病性、果實形狀、顏色、口感、熟性、風味以及雌雄花分化等關鍵基因的功能得以詮釋，為CRISPR-Cas9技術成功應用于蔬菜育種提供了豐富的基因資源。

3.1 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物生物脅迫抗性

利用基因編輯系統提高植物對病毒的抗性，主要采用2種思路：一是促使病毒基因組中編碼外殼蛋白的基因或者病毒復制子發生基因突變，二是敲除參與作物抗病毒途徑的關鍵基因。馬鈴薯Y病毒屬基因組連接蛋白（Virus genome-linked protein，VPg）與植物真核翻譯起始因子4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）的結合在Y病毒屬病毒侵染植物過程中起關鍵作用，通過突變eIF4E的關鍵位點能影響病毒-植物的互作，并介導植物對病毒的抗性［38］。在黃瓜中利用CRISPR-Cas靶向突變感病elF4E基因型的N′和C′末端，獲得非轉基因的純合植株表現對黃瓜脈黃化病毒（Cucumber vein yellowing virus）的免疫以及西葫蘆花葉病毒（Potyviruses Zucchini yellow mosaic virus）和木瓜環斑花葉病毒-W（Papaya ring spot mosaic virus-W）的抗性［39］。根據植物雙生病毒甜菜曲葉病毒基因組的編碼區和非編碼區序列信息，設計不同組合CRISPR-sgRNA表達載體，瞬時轉化至煙草、擬南芥葉片，檢測轉化不同組合的葉片表面病毒積累量，得出相比對編碼區的突變，對非編碼區的突變既能降低甚至抑制病毒的復制能力，又能減少病毒變體的產生［40］。真菌性病害如霜霉病和白粉病是導致蔬菜產量和品質下降的重要原因［23］。擬南芥的DMR6（Downy mildew resistant）基因屬于以Fe（Ⅱ）作為輔因子的2-氧代戊二酸加氧酶，參與了水楊酸穩態，超表達能提高對霜霉病的感病性［41］。利用基因CRISPR-Cas9使番茄中的AtDMR6同源基因突變，所得的DMR6突變體對假單胞桿菌、疫霉屬菌、黃單胞菌屬具有抗病性。Mlo1（Mildew resistant locus 1）編碼膜結構相關蛋白，是白粉病敏感型基因。利用CRISPR-Cas9使番茄中的Mlo1基因突變，產生對白粉病（Oidium neolycopersici）的抗性［42］。PMR4（Powdery mildew resistance 4）編碼胼胝質合成酶，能對白粉菌產生抗性。蔬菜真菌性病害尖孢鐮刀菌能夠引發 枯 萎 病［43］。利 用CRISPR-Cas9敲 除 番 茄Solyc08g075770基因提高對枯萎病的敏感性［44］。灰霉病菌屬于氣傳病害，可以隨空氣、水流以及農事操作等方式傳播，是設施蔬菜普遍發生且難以防治的真菌性病害。番茄果實采收后尤其容易感染灰霉病，利用CRISPR-Cas9技術使MAPK3（Mitogen-activated protein kinase 3）基因突變能夠增強對灰霉病的抗病性［45］。丁香假單胞菌（Pseudomonassyringae）是重要的植物細菌致病菌，能夠感染50多種農作物。在侵染過程中，先定植于植物葉片表面，再利用鞭毛裝置運動到葉片背部氣孔，通過Ⅲ型分泌系統（TypeⅢsecretion system，T3SS）將T3SS效應蛋白注射到宿主細胞，進而導致宿主致病。在擬南芥中JAZ2（Jasmonatezim domain protein 2）基因能夠表現對丁香假單胞菌的抗性，研究者利用CRISPR-Cas9使番茄JAZ2基因的C′末端茉莉酸相關結構域（JAZ2Δjas）突變，得到JAZ2抑制子植株，表現出對丁香假單胞菌的抗性［46，47］。

3.2 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物非生物脅迫抗性

油菜素內酯相關的抗性基因（Brassinazole resistant 1，BZR1）調控著油菜素甾醇（Brassinosteroid，BR）反應。利用CRISPR獲得的bzr1突變體以及BZR1超表達的突變體研究得出，BZR1基因參與調控植物的耐冷途徑［48］。SlMAPK3（Solanum lycopersicum mitogen-activated protein kinase 3）基因參與了番茄的干旱脅迫反應，保護植物細胞膜免受過氧化損傷，利用基因編輯技術使上述基因突變，能夠獲得耐冷和耐旱的新種質資源［49］。

3.3 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物除草劑抗性

雜草是影響蔬菜產量和品質的重要脅迫因素，生產上通常使用選擇性除草劑來防治。為了獲得抗除草劑的瓜果類蔬菜，并應用于田間生產，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術，使西瓜中除草劑靶標基因乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）定向突變，獲得抗除草劑的西瓜種質［50］。利用胞嘧啶單堿基編輯技術（Cytidine base editing，CBEs）使番茄和馬鈴薯ALS編碼區產生C-T的轉換，導致氨基酸的突變，在番茄中高達71%精準編輯的植株表現為對氯磺隆除草劑的抗性，并且在番茄和馬鈴薯中分別有12%和10%的編輯植株無轉基因成分［51］。列當屬植物是一類植物專性寄生的雜草，需要宿主根系釋放植物激素獨腳金內酯（Strigolactones，SLs）促進種子萌發。利用CRISPR-Cas9突變番茄中類胡蘿卜素合成途徑中類胡蘿卜素雙加氧酶8（Carotenoid Cleavage Dioxygenase 8，CCD8），所得突變體中SLs合成基因表達量降低，導致植株體內SLs含量下降，進而抑制專性寄生列當屬雜草種子的萌發［52，53］。

3.4 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物的品質

蔬菜的品質育種目標包括改良感官和營養品質。感官品質主要是果實大小、顏色、紋理和質地。番茄子房心皮室的數目決定了50%果實大小的遺傳變異，而心皮室數目由多個QTLs所決定［54］。利用CRSIRP-Cas9對SlCLV3的啟動子區編輯，產生了一系列順式調控的等位基因，不同SlCLV3轉錄水平導致植株果實大小、花序形態、心室數目的差異［55，56］。果實的顏色和質地是蔬菜作物重要的感官性狀。研究者根據不同區域人群對蔬菜感官的需求，應用CRISPR-Cas技術實現定向育種。利用CRISPR-Cas工具靶向突變八氫番茄紅素合成酶基因（Phytoene synthase 1，PSY1）、MYB轉錄因子（MYB12）、花青素酶基因（Anthocyanin 2，ANT2）可以獲得黃色、粉色以及紫色的番茄［57-59］。營養品質的改良主要涉及含糖量、維生素以及生物強化復合物等。碳水化合物和維生素是重要的營養物質。多個基因參與了蔗糖和類胡蘿卜素（在人體中維生素前體A能夠被吸收并轉化為維生素A）的合成與代謝。比如利用CRISPR-Cas敲 除MPK20（Mitogen-activated protein kinase 20）基因，能夠阻斷蔗糖代謝途徑中多個基因的轉錄［60］。生物強化被定義為利用現代生物技術手段提高植物對礦物質的吸收、轉移和代謝能力，有益于人體健康的微量元素富集于食物中，長期食用能有效預防心血管疾病和癌癥［61］。花青素［62］、蘋果酸酯［63］、γ-氨基丁酸GABA［64］以及番茄紅素［65］等被認為是生物強化物質，利用CRISPR-Cas9技術調控代謝途徑的關鍵基因能夠在果實中富集這類營養物質，比如編輯GABA合成途徑中的多個基因能夠使番茄中GABA的含量增加11～12倍［66］；調控鋁酸鹽轉 運 子（Aluminum-activated malate transporter 9，ALMT9）能夠改良番茄果實中蘋果酸鹽的含量［63］。對生菜維生素C合成限速酶基因（LsGGP1和Ls-GGP2）的上游表達調控元件（uORF）精準編輯能夠提高mRNA翻譯水平，使得維生素C含量顯著提高［67］。利用CRISPR-Cas9技術敲除7-脫氫膽固醇還原酶的特定亞型SL7-DR2，能夠導致成熟番茄果實中7-DHC含量大量增加，通過紫外線處理編輯番茄果實能夠促使7-DHC轉化為維生素D3，1個番茄中含量相當于2個中等大小雞蛋或28 g金槍魚，由于該維生素D合成途徑也存在于茄子、馬鈴薯、辣椒等其他茄科植物中，因此，可以采用類似方法提高維生素D含量［68］。除了上述提高蔬菜作物有益人體健康的營養成分外，同時還可以通過降低對人類食用有風險物質的含量來提高品質。在馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿（SGAs）如α-茄堿和α-卡茄堿含量過高會嚴重影響口感，并導致食用風險，利用CRISPR-Cas9技術敲除馬鈴薯SGA生物合成途徑中類固醇16α-羥化酶（St16DOX）基因，獲得無SGA的優良種質資源［69］。茄子多酚氧化酶（Polyphenol oxidase genes，PPOs）是引起果實酶促褐變的主要原因，對茄子與果實氧化相關的3個多酚氧化酶基因（SmelPPO4、SmelPPO5、SmelPPO6）同時突變能夠顯著降低茄子果實的褐化［70］。

3.5 CRISPR-Cas9在蔬菜作物馴化中的應用

高產和適宜大規模農業生產的栽培作物都經歷了長期的馴化和選育。隨著作物遺傳改良，遺傳多樣性、抗病和抗環境脅迫能力逐漸降低，通過傳統雜交的方式將野生種的優良性狀再次導入栽培種耗時費力且常伴隨遺傳累贅。利用CRISPR技術可以修飾野生種中重要的馴化基因，快速獲得產量、品質、抗逆性俱佳的新作物，這個過程被稱為從頭馴化（Denovodomestication）。中國科學院遺傳與發育生物學研究所許操研究組和高彩霞研究組合作，選用天然耐鹽堿和抗細菌瘡痂病的野生醋栗番茄（Solanumpimpinellifolium）作為基礎材料，用基因編輯技術精準靶向開花的光周期敏感性、株型和果實同步成熟控制基因SP和SP5G的編碼區、果實大小控制基因SlCLV3和SlWUS的順式調控元件和維生素C合成酶基因SlGGP1的上游開放閱讀框（Upstream open reading fragment，uORF）［71］，在保證野生番茄對鹽堿和瘡痂病天然抗性的前提下，消除了開花的光周期敏感性，突破了栽種地域限制，同時將醋栗番茄開花晚、坐果稀的無限生長型（Indeterminate）的株型變成了雙有限生長型（Double determinate）的緊湊株型，提高了坐果率、果實成熟的同步性和收獲指數。對小肽基因SlCLV3及其信號途徑下游基因SlWUS的順式調控元件和SlGGP1上游開放閱讀框的編輯使野生番茄果實變大，維生素C含量升高［55］。美國冷泉港霍華德休斯醫學研究所與康奈爾大學博伊斯湯普森研究所合作，對富含維生素和抗氧化劑的番茄近緣種印加酸漿（Physalispruinosa）又名紅菇娘進行從頭馴化。利用CRISPR基因編輯技術敲除SELF-PRUNING5G基因使植株形態發生改變，停止發芽和生長葉子轉而生長更多的花和果實，最后使得果實數量增加50%；突變CLV1基因后果實重量增加24%。傳統育種可能需要數十年才能完成改良，而基因編輯技術在不到2年內通過兩個關鍵的馴化基因突變獲得了優良品種［72］。巴西維索薩聯邦大學領銜的研究團隊將野生番茄中存在的優良性狀與農藝學上所需性狀相結合，選擇當前番茄品種中決定產量和品質的6個基因進行基因編輯，成功地改變了野生番茄的形態、果實大小、數量和營養價值，尤其是番茄紅素積累量相比廣泛栽培種Solanumlycopersicum提高了500%［73］。

3.6 優化CRISPR-Cas載體系統獲得非轉基因植株的方法

自1996年首例轉基因農作物產業化應用以來，轉基因農作物新品種研發從抗蟲、抗除草劑等第一代產品向改善營養品質和提高產量的第二代產品轉變，并顯示良好的市場開發前景。但是轉基因過程引入了外源DNA片段可能會影響插入位點相鄰基因的表達［5］。CRISPR-Cas9能直接對目標性狀基因進行修飾，之后通過自交或者雜交剔除外源基因以消除轉化外源片段的安全顧慮。蔬菜作物種類繁多，有的以基因型雜合形式存在，自交以及雜交不親和，生育期長，基因組復雜度高，如三倍體或多倍體等以營養體繁殖。為能獲得無轉基因成分的CRISPR-Cas9基因編輯的植株，研究人員開發了2種方法：①基于位點特異性重組酶（Site-specific recombinase flippase，Flp）方法［74］。Flp能夠識別34 bp長的FRT序列。Flp/FRT系統能有效剔除轉基因蘋果以及葡萄中的T-DNA表達組件［75-77］；②依賴于Cas9蛋白的剪切機制。在CRISPR-Cas9載體的LB和RB端合成一段靶序列，命名為剪切靶位點（Cleavage target sites，CTS）。當CRISPR-Cas9載體轉化到植物中時，Cas9蛋白剪切內源基因靶位點的同時也能剪切CTS，最終將T-DNA區域的外源片段從基因組中釋放，從而獲得T-DNA free的植株［75］。

4 CRISPR-Cas基因編輯技術在蔬菜育種中的挑戰及展望

得益于蔬菜作物全基因組測序數據的公開以及功能基因組學的迅速發展，CRISPR-Cas9技術已經在蔬菜育種中應用。但未來CRISPR-Cas技術的應用面臨兩個挑戰：一是準確選擇靶向突變的關鍵基因。通常重要的農藝性狀是復雜的數量性狀，編輯單個基因并不會產生表型的變化，因此利用CRISPR-Cas介導的靶位點特定插入以及染色體重組方法能夠聚合多個突變的等位基因［78-80］。利用基因編輯技術阻斷特定基因的表達會導致植物適應性降低，因此需要對基因功能進行高效特異的精確調控。植物的順式作用元件（Cis-regulatory elements，CREs）是非編碼DNA序列，常決定了基因的轉錄，其中基因調控區單核苷酸的突變、插入、缺失、倒位以及表觀遺傳變異與作物的馴化息息相關［81］，利用CRISPR-Cas對基因調控區突變能夠產生數量性狀的變異，導致多樣化的表型。目前蔬菜作物CREs的基因編輯還處于起步研究階段，接下來需要將不同突變型的CREs所產生的表達量變化同相應的表型關聯起來，通過對CREs的基因編輯獲得豐富的育種資源；二是建立適應于不同類蔬菜的基因組編輯技術。雖然目前能通過農桿菌或者基因槍介導CRISPR-Cas元件轉化外植體，PEG或者電穿孔法介導原生質體轉化，但是開發具有普適高效的遺傳轉化技術應用于蔬菜作物的基因編輯仍存在較大難度，CRISPR-Cas組件遺傳轉化效率以及轉化組織再生成植株的能力成為技術應用的限制因素。為提高農桿菌轉化以及轉化后再生能力，可利用革蘭氏陰性細菌如丁香假單胞細菌的分泌系統T3SS在農桿菌中表達，將三型效應子T3Es如AvrPto、AvrPtoB、HopAO1運送到細胞中，通過阻斷植物PTI反應提高農桿菌介導的轉化效率［82］。在CRISPR-Cas表達系統中同時超表達植物形態建成的調控基因LEAFY COTYLEDON1、LEAFYCOTYLEDON2、WUSCHEL（WUS）、BABYBOOM（BBM）、GRF4（GROWTH-REGULATINGFACTOR4）和互 作因 子GIF1（GRF-INTERACTINGFACTOR1）促使轉化后的再生［83-85］。