一株防病促生細菌HPS-211菌株的分離與初步鑒定

黃 薇，謝媛圓，金利容，周劍雄，熊又升，曾祥國

（湖北省農業科學院，a.植保土肥研究所/農業農村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室/農作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室；b.經濟作物研究所，武漢 430064）

草莓屬多年生草本植物，可鮮食，營養價值高，風味好，能制成多種草莓深加工產品，如果醬、果干等，深受廣大消費者的喜愛［1］。中國的草莓產業在過去十年間發展迅速，根據聯合國糧農組織（FAO）最新統計，2020年中國草莓種植面積為12.72萬hm2，在世界草莓種植面積中占比最高。中國草莓種植主要采用一年一栽的連作模式，導致生產上連作障礙嚴重，帶來極大的損失，如草莓苗的萎蔫、倒伏或是草莓不掛果，嚴重時甚至會造成整壟死苗，目前主要依靠土壤熏蒸和化學防治等多手段進行田間管理［2］。土壤環境的連作障礙、草莓苗的病蟲害發生較重以及農藥的使用量過多等問題，極大地影響了草莓的品質和鮮食安全［3］，草莓灰霉病就是其中的重要影響因素之一。草莓灰霉病對草莓生長和采摘前后都存在較大危害，其病原物為灰葡萄孢（Botrytiscinerea）［4］，以菌絲體、分生孢子隨病殘體或以菌核形式在土壤內越冬，翌年通過氣流、澆水或農事活動等途徑傳播［5］，分生孢子在溫度0～35℃，相對濕度81%以上均可萌發［6，7］，且無抗病品種，導致該病害易發難防。

植物病害的發生不僅與病原、環境有關，亦與植物自身狀態密切相關，植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）作為一類可定殖于植物根際系統并能促進植物生長的細菌，其通過促進植物生長來提高植物抗逆性的報道較為常見［8］，其種類繁多，不僅對植物有顯著促生長作用，對抑制土傳病害的發生、增強植物抗逆脅迫能力、改善土壤生態環境等方面也有重要作用［9-11］。周貝貝［12］在草莓根際篩選中得到4株PGPR菌株，具有產蛋白酶、解磷和拮抗病原菌的能力。防病和促生作用是生防菌株應用于生產實踐必備的兩個功能，也是用于篩選拮抗菌株的重要指標，本試驗希望篩選具備促生和拮抗真菌功能的PGPR菌株，擬以梯度稀釋法從草莓連作和休耕土壤中分離得到可培養的細菌單菌落，通過與真菌對峙共培養篩選，了解其對真菌的拮抗作用并對其進行效果評價，應用于盆栽試驗，驗證其促生效果并進行分子鑒定，為新型微生物農藥的研制和應用提供更多資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：小麥赤霉病菌（Fusariumgraminearum）HB-11、灰 霉 病 菌（Botrytiscinerea）B05.10、黃連炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）H8-20、稻曲病菌（Ustilaginoideavirens）QJ-1由湖北省農業科學院植物病理團隊和水稻團隊提供；棉花黃萎病菌（VerticilliumdahilaeKieb.）V991、棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporium）均由湖北省農業科學院植物病理實驗室分離和保存。

蔬菜品種：番茄、辣椒、茄子種子均購于農資公司。培育蔬菜所用的基質土為中國農業科學院研發的育苗專用基質土。草莓品種為紅顏，由湖北省農業科學院經濟作物研究所韓永超課題惠贈。

供試培養基為馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）和牛肉膏蛋白胨培養基（NA）及相應的固體培養基。苯丙氨酸解氨酶（PAL）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、過氧化氫（H2O2）試劑盒和葉綠素含量測定試劑盒來自于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 草莓拮抗真菌菌株的分離純化 采用五點取樣法，2021年從武漢市黃陂區禾盛吉農場采回8年連作不結果和休耕2年的草莓田土樣，取根際周邊10 cm、深度約10 cm的土樣以及草莓灰霉菌典型發病株若干份，分別裝在采樣袋中帶回實驗室，備用。

根際細菌的分離：取10 g根際土，加入90 mL無菌水懸浮液，25℃、180 r/min振蕩10 min，獲得10-1稀釋液，依次梯度稀釋，取0.1 mL的10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液涂布于NA平板，置于28℃培養箱中培養，48 h后挑取顏色、光澤、邊緣光滑度和厚度不同的單菌落于新的NA平板上進行劃線培養，對所得菌株編號并斜面保存，備用［13］。

1.2.2 分離細菌對植物病原真菌的拮抗活性的初篩 采用平板對峙法［14］，將病原菌菌餅接種至PDA平板中央，在平板四面距平板中央各2.5 cm的地方平行劃線接種待測分離細菌菌株，于25℃培養箱中培養。每個處理3次重復，2 d后檢查各菌株的抑菌效果。

1.2.3 分離細菌對草莓灰霉菌拮抗活性的復篩 將初篩的菌株分別接種于NA中，于28℃、130 r/min的搖床上培養48 h。在PDA平板中央接種培養72 h的灰霉菌菌餅（直徑5 mm），用無菌的打孔器在距離中央2 cm處三點對稱打孔，每孔中分別注入0.1 mL待測菌株的菌液，以接種等體積的NB為對照，每個處理3次重復，平板置于28℃恒溫培養箱中培養，待對照平板中灰霉菌菌絲即將長滿全皿時，測量各處理組的抑菌帶大小。

1.2.4 細菌HPS-211抑菌譜的測定 參照Jeong等［15］的方法并稍作改進，制備細菌HPS-211發酵3 d的無菌濾液，將無菌濾液混入冷卻至55℃左右的PDA培養基中，使其終濃度為10%，倒成平板。以混入相同體積的NA為對照。在PDA平板中央接入待測病原菌菌餅，28℃倒置培養。每處理4次重復。待對照組菌絲幾乎長滿培養皿時，采用十字交叉法，測量各組的病原菌菌落直徑，計算相對抑制率［16］。

1.2.5 HPS-211對3種植株生理及生長指標的測定 番茄、辣椒、茄子的種植采用常規管理方法，生防菌液的制備同“1.2.4”。以接種等體積的NA為對照，每處理12株植株，3次重復。將植株放在（25±2）℃溫室中培養，光照∶黑暗=14 h∶10 h，30 d后，通過測定植物的株高、根重、生物量（鮮質量和干質量）以及含水量，分析接種細菌對植物生理生長的影響。取植物第三片真葉，采用PAL、葉綠素、丙二醛、過氧化氫酶試劑盒分別測定葉片中的苯丙氨酸解氨酶含量、葉綠素含量、丙二醛含量和過氧化氫酶的含量。

1.2.6 細菌對草莓灰霉病的影響 待草莓苗長至4～5片真葉后，將其從基質移栽至塑料盆里。設置4個處理：①病原菌B05.10+提前3 d接種細菌；②病原菌B05.10+同時接種細菌；③病原菌B05.10+NA；④清水對照。灰霉病原菌B05.10接種到PDB中，28℃、130 r/min振蕩培養5 d，經4層紗布過濾得到1×108CFU/mL的孢子懸浮液，對草莓植株頂葉噴施孢子懸浮液。

制備HPS-211懸浮液（2×108CFU/mL），接種時對草莓幼苗進行灌根，每株接種20 mL。以接種等體積的NA為對照，每個處理22株草莓苗，3次重復。草莓植株均置于（25±2）℃溫室中培養，光照：黑暗=14 h∶10 h。接種病原菌B05.10后，從接種后15 d開始調查草莓植株的發病嚴重度，并計算相應的病情指數。

1.2.7 細菌的分子鑒定 參照沈萍等［17］的方法，對細菌進行革蘭氏染色。使用OMEGA細菌基因組提取試劑盒提取細菌的總DNA，采用16SrDNA基因通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進 行PCR擴增。反應體系：PCR preMix 12.5μL、正引物1.0μL、反引物1.0μL、DNA 2.0μL和ddH2O 8.5μL；擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性60 s、58℃退火90 s、72℃延伸60 s，變性、退火和延伸循環35次；72℃繼續延伸10 min；4℃保存。取少量PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。所得序列在NCBI的GenBank中進行比對分析，利用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹。

1.3 數據分析

采用SPSS17.0軟件進行Duncan’s多重比較，檢驗組間差異顯著性，數據表示為平均數±標準差。

2 結果與分析

2.1 草莓灰霉病拮抗真菌的分離和初篩

由表1可知，從草莓8年連作和休耕土樣中分離得到了465株細菌，經平板對峙初篩，得到若干株可拮抗赤霉菌或灰霉菌的細菌，其中5株在平皿上可以同時拮抗赤霉菌和灰霉菌，可以進一步對其拮抗活性進行研究。

2.2 草莓拮抗菌株的復篩

拮抗活性復篩（表2）發現，抑菌帶寬超過5 mm的菌株共有9株，其中細菌HPS-211和HPS-32對灰霉病菌B05.10的抑制活性最強，形成的抑菌帶寬達10 mm左右，且對赤霉菌HB1-1的抑制活性也較強，本試驗選擇HPS-211作為后續研究菌株。

表2 拮抗細菌的復篩

2.3 抑菌譜的測定

由表3可以看出，HPS-211的無菌濾液在10%濃度下對6種供試病原菌有不同程度的抑制作用，其中，對赤霉菌HB-11抑制活性較弱，而對其他5種真菌生長的抑制率為29.47%～57.50%，對大麗輪枝菌的抑制率最高。細菌發酵液對小麥赤霉菌HB-11的抑制率最低，為6.06%，其次為黃連炭疽菌ES-3、灰霉菌B05.10、棉花枯萎菌S3-8和稻曲菌QJ-1，細菌發酵液對棉花黃萎病菌V991的抑制率達57.50%。細菌發酵液對6種真菌菌落生長組間存在極顯著差異。

表3 10%濃度的HPS-211發酵液對真菌的影響

2.4 細菌對真菌的拮抗作用

如圖1所示，細菌HPS-211對小麥赤霉菌HB-11的生長基本無影響，菌落和氣生菌絲的生長均無抑制作用；對灰霉菌B05.10有一定的抑制作用，但隨著培養時間的延長，對菌落生長的抑制作用逐漸減弱；對棉花黃萎病菌、黃連炭疽菌、棉花枯萎病菌和稻曲菌的菌落生長可產生較為明顯的抑制，且可持續一段時間。其中，對棉花黃萎病菌的抑制效果最為明顯。

圖1 細菌HPS-211對6種真菌的拮抗作用

2.5 細菌對植物生理及生長指標的影響

由表4可知，接種細菌HPS-211 30 d后，對3種植物的生理指標均產生了一定的影響。與對照相比，3種植物葉片中的葉綠素含量均有提高，但差異不顯著；苯丙氨酸解氨酶含量在3種植物中均有所下降，番茄和茄子中的苯丙氨酸解氨酶含量均顯著低于對照，且以番茄葉片中的苯丙氨酸解氨酶含量下降幅度最大；接種細菌HPS-211對番茄的株高和單株鮮重有促進作用，平均分別提高了14.5%和26.9%，但對辣椒的株高無顯著影響，且鮮重略有下降，對茄子株高和鮮重的影響均不顯著。

表4 接種細菌HPS-211 30 d后對3種植物生理及生長指標的影響

2.6 細菌對草莓灰霉病的影響

由表5可知，接種細菌HPS-211和灰霉病菌的草莓苗與僅接種灰霉菌的草莓苗相比，在病情指數上都存在顯著性差異，且差異均達極顯著水平。接種15 d后的病情指數已出現顯著性差異，接種25 d后僅接種灰霉菌草莓苗的病情指數是接種細菌HPS-211和灰霉菌處理的2倍多。根據調查結果，推測接種期間細菌HPS-211對草莓植株的影響能持續發揮作用。

表5 接種25 d內菌株HPS-211對草莓灰霉病病情指數的影響

2.7 細菌HPS-211對草莓生長的影響

如圖2所示，與清水對照相比，草莓植株在接種細菌HPS-211后，能正常開花、結果，表明接種細菌HPS-211并不影響草莓的掛果，且草莓植株的株高、葉色、葉面積等指標還出現較大的改觀。接種細菌HPS-211 25 d后，噴施灰霉菌孢子懸浮液且同時接種細菌HPS-211的草莓植株平均株高為28.4 cm，葉綠素含量平均為2.82 mg/g；清水對照草莓植株平均株高約為24.7 cm，葉綠素含量平均為2.63 mg/g，噴施B05.10+HPS-211處理的株高和葉綠素含量均極顯著高于清水對照（表6）。而未接種細菌HPS-211的草莓葉片呈深綠色，植株葉片的成熟度更高，老化程度高于接種細菌HPS-211的植株。

表6 草莓植株的株高和葉綠素含量

圖2 噴施接種灰霉菌孢子液和清水對照的草莓植株

2.8 HPS-211的分子鑒定

HPS-211菌株的菌落為淡黃色，表面平整干燥，呈半透明狀態，邊緣規則，菌落略有異味。經革蘭氏染色判斷其為革蘭氏陰性菌，為桿菌，經芽孢和鞭毛染色鏡檢后，發現有鞭毛結構，但無芽孢。通用性引物27F/1492R經基因擴增后發現，HPS-211菌株的16SrDNA序列長度為1 423 bp，經Blast分析表明，其與偶氮假單胞菌（Pseudomonasazotoformansstrain，KGGI16）的16SrDNA序列具有99%的相似度。系統發育進化樹（圖3）顯示，菌株HPS-211與偶氮假單胞在同一分支上，將該菌株初步鑒定為偶氮假單胞菌。

圖3 細菌HPS-211的系統進化樹

3 小結與討論

3.1 細菌HPS-211的生物學特性和抑菌效果

細菌HPS-211為革蘭氏陰性桿菌，其菌落為淡黃色，表面干燥呈半透明狀態，邊緣規則，菌落略有異味。經染色鏡檢后，發現有鞭毛，無芽孢。細菌HPS-211對赤霉菌的抑制作用不明顯，但對灰霉菌存在一定的抑制作用，對峙試驗中菌液可對真菌形成明顯的抑菌圈，且細菌發酵液對灰霉菌的生長抑制率為29.47%，對6種真菌，除赤霉菌外，均存在一定的抑制效果，對棉花黃萎病菌的生長抑制作用最強。由于稻曲菌和黃萎病菌屬于生長較緩慢的真菌，可能易受到外界環境的擾動，而對赤霉菌和灰霉菌這類生長速度較快的真菌影響效果則不顯著，隨著培養時間的延長，氣生菌絲仍會覆蓋到接種細菌的平皿部位。

3.2 HPS-211菌株對番茄葉片中多種酶類的影響

HPS-211菌株對番茄的生理影響最為顯著，處理后番茄葉片中的苯丙氨酸解氨酶、過氧化氫酶、丙二醛含量均低于對照，其中，苯丙氨酸解氨酶含量極顯著低于對照，而葉綠素含量高于對照，但差異不顯著。苯丙氨酸解氨酶是一類與植物抗逆性相關的酶類，它的活性與木質素、花青素、類黃酮等次生代謝物質的積累呈顯著性正相關［18］。本研究表明，細菌HPS-211能顯著提高番茄的株高，且極顯著提高番茄的鮮重，是否能提高番茄的抗逆性還有待進一步的研究。

植物在正常狀態下，植物中活性氧的產生和清除過程呈平衡狀態，當受到蟲害或是機械損傷時，體內活性氧代謝系統平衡會受影響，細胞膜脂結構遭到破壞。MDA含量是植物細胞膜脂過氧化的一個重要指標，MDA含量的大量增加，表明體內細胞受到較嚴重的破壞［19］。梁鄲娜等［20］發現蚜蟲侵染黃瓜后，抗感品系葉片中MDA含量均有上升。接種細菌HPS-211 30 d后，番茄葉片中的MDA與對照相比有所降低，但二者之間差異未達顯著性水平，表明接種細菌HPS-211后并未對植物細胞膜脂結構造成明顯的干擾。在正常狀態下，植物中H2O2的產生和清除過程呈平衡狀態，H2O2含量與植物的抗病防御反應密切相關［21］。過氧化氫酶可催化過氧化氫轉化為氧氣和水，降低H2O2對植物體產生的傷害，是生物體防御反應體系的重要酶類之一。在一定程度內，H2O2含量越高，過氧化氫酶的分解速度越快。接種細菌HPS-211后降低了番茄葉片中過氧化氫酶的含量，表明接種細菌HPS-211可能并不會誘發番茄的抗病防御。

3.3 細菌HPS-211對幾種植物的促生效果

促生菌可以通過直接機制，如產生植物生長素或是促進養分的吸收和利用，或通過間接機制，如影響酶活性，促進營養競爭和產生系統抗性等，進而促進植物的生長［22］。通過接種HPS-211菌株到番茄、辣椒、茄子和草莓上，發現與對照相比，其對番茄和草莓植株的株高、葉色、葉面積和根系均有較顯著的促進作用，株高更高，葉色更加鮮嫩翠綠，葉面也更寬大。對辣椒的促生作用不顯著，但提高了辣椒葉片的葉綠素含量，葉色更加有光澤，接種HPS-211可能提高了辣椒葉片的光合效率，促進光合作用。但接種細菌HPS-211對茄子的促生作用不明顯。

葉綠素是植物進行光合作用的基礎物質，也是反映植物光合能力和健康狀態的重要指標，對作物的產量和品質有顯著影響［23］，有研究表明在病原菌的脅迫下，植物的葉綠素含量與植物抗性呈正相關［24］。與清水對照相比，草莓在接種細菌HPS-211后，也能正常開花、結果，表明接種細菌HPS-211不影響草莓的掛果。對照草莓植株葉片的成熟度更高，老化程度高于接種細菌HPS-211的植株。細菌HPS-211對其他植物是否也存在類似的促生作用，還有待進一步的研究來證實。