心肌缺血循環血微囊泡對大鼠心肌I/R損傷的保護作用研究

常明，金銀浩，于倩倩，馬淑敏，劉桂清

齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院心血管內科二病區，黑龍江齊齊哈爾 161041

急性心肌梗死是全球范圍內致死致殘的主要病因。早期冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention, PCI）是減小梗死面積、改善心肌及全身血灌注的有效方法，但再灌注造成心肌損傷進一步加重，降低PCI治療的臨床效果凈獲益，即被稱之為心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfution, I/R）損傷[1-3]。I/R損傷是一個復雜的病理過程，包括多個細胞信號通路地激活，效應基因表達水平地變化，多種不同蛋白質分子地分泌，最終引起心肌細胞代謝過程紊亂、超微結構地改變，引起心功能異常[4]。研究文獻表明，早期梗死血管開通后，大約1/3的患者出現I/R損傷，使心肌細胞凋亡進一步加重，并導致不可逆的梗死區擴張，還可引起左心室重構，使遠期預后惡化[5]。減輕I/R損傷仍然是缺血心肌獲得最佳治療效果的主要問題。細胞微囊泡（microvesicles, MVs）是機體細胞在激活或凋亡過程中釋放至細胞外的一種膜性囊泡樣物質。研究發現，大鼠經歷慢性缺氧損傷后，循環血中的MVs可以通過降低體內NO水平誘發大鼠主動脈和肺動脈的內皮功能紊亂[6]。也有報道顯示，MVs對心肌具有保護作用[5]。本研究以35只Wistar大鼠為研究樣本，建立大鼠I/R模型，觀察MVs對其影響作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠35只，3～6個月齡，體質量240～260 g。其中5只用于提取MVs，另外30只用于進行體I/R損傷實驗，隨機分為3組，每組10只。

1.2 方法

1.2.1 Mvs的提取與檢測 在大鼠腹腔注射25%烏拉坦（國藥準字H37022259，規格：1 g/kg），麻醉后行頸動脈插管，開胸連接呼吸機，暴露心臟，結扎冠狀動脈左前降支造成心肌缺血，操作完成后再松開結扎絲線5 min實現再灌注，按上述方法循環操作3次，建立I/R模型。采集大鼠腹主動脈，2 600×g離心15 min提取上清，再進行10 000×g離心5 min提取無血小板血清，采用多聚甲醛（CAS:30525-89-4）固定后，其中一部分采用流式細胞儀檢測MVs。另一部分超速離心后取沉淀物，蛋白質濃度測定方法(bicinchoninic acid， BCA)進行蛋白定量，-80℃保存備用。

1.2.2 分組與處理 將30只大鼠隨機分為3組，A組為假手術組，在冠狀動脈左前降支下穿一絲線后曠置150 min；B組為I/R組，采用結扎冠脈左前降支的方法造成缺血30 min，再灌注120 min；C組為MVs組，與B組相同方法造成I/R損傷，在缺血25 min時，從股靜脈注射MVs7 mg/kg。

1.3 觀察指標

1.3.1 心肌梗死面積 再灌注120 min后，對冠脈左前降支進行結扎，選擇股靜脈注射臺盼藍進行細胞染色。取心臟經低溫處理后切成約1 mm薄片，置入1%TIC溶液中，于常溫下避光孵育10 min，使用福爾馬林溶液固定。將呈現為灰白色的部位（梗死區）和磚紅色區域（危險區）分別從心肌組織中分離，用電子天平精確稱重，計算其梗死區/危險區比值，作為梗死面積的指標。

1.3.2 心肌細胞凋亡檢測 將心臟切片進行石蠟包埋、熒光染色。使用光學顯微鏡高功率放大(×400)，隨機選取10個高倍視野，觀察凋亡陽性心肌細胞數量，取其與心肌細胞總數的比值作為心肌細胞凋亡指數。

1.3.3 血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性 于3個時間點（麻醉后、缺血30 min、再灌注120 min）分別采集實驗大鼠股靜脈血0.2 mL。離心處理后采用比色法檢測LDH水平。

1.3.4 心肌組織caspase 3活性 取大鼠左室前壁心肌勻漿，于4℃條件下進行18 000×g高速離心，將組織蛋白提取出來，采用Bradford法定量測定。使用微量酶標儀檢測caspase 3活性。

1.3.5 Bcl-2及Bax表達水平 心肌組織加入Western及IP細胞裂解液，使其完全裂解后勻漿，提取蛋白，BCA法進行蛋白定量。采用Western blot法檢測B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）及Bcl-2關聯X蛋白（Bcl-2-associated X protein， Bax）表達。條帶的灰度值通過Quantity One軟件分析。

1.4 統計方法

采用SPSS 19.0統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Mvs的流式檢測結果

流式檢測顯示，Mvs濃度為（4 284±738）cells/μl。

2.2 3組心肌梗死面積比較

B組梗死區面積明顯高于C組，差異有統計學意義（t=3.167，P=0.005）；B組與C組危險區面積比較，差異無統計學意義（t=0.552，P=0.588）；B組梗死區/危險區比值高于C組，差異有統計學意義（t=6.094，P＜0.001）。見表1。

表1 3組心肌梗死面積對比(±s)

表1 3組心肌梗死面積對比(±s)

注：與B組比較，*P＜0.05

組別A組（n=10）B組（n=10）C組（n=10）梗死區（mg）84.72±13.28（67.21±11.37）*危險區（mg）213.44±32.71 205.87±28.46梗死區/危險區（%）38.79±4.22（26.86±4.53）*

2.3 3組心肌細胞凋亡情況比較

B組心肌細胞凋亡指數高于C組，C組高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組心肌細胞凋亡情況對比[(xˉ±s)，%]

2.4 3組LDH活性水平比較

麻醉后，3組LDH活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；缺血30 min，B組、C組LDH高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05），B組與C組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；再灌注120 min，B組LDH活性高于C組，C組高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 3組LDH水平對比[(±s)，U/mL]

表3 3組LDH水平對比[(±s)，U/mL]

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

組別A組（n=10）B組（n=10）C組（n=10）麻醉后2.42±0.53 2.58±0.65 2.51±0.74缺血30 min 4.53±1.04（6.84±1.28）*（6.53±1.17）*再灌注120 min 7.68±1.38（13.45±2.15）*（10.38±2.21）*#

2.5 3組caspase 3活性、Bcl-2及Bax表達水平比較

C組caspase 3活性、Bax表達水平低于B組，Bcl-2表達水平高于B組，差異有統計學意義（t=13.889、3.357、3.988，P＜0.05），見表4。

表4 3組caspase 3活性、Bcl-2及Bax表達水平對比(±s)

表4 3組caspase 3活性、Bcl-2及Bax表達水平對比(±s)

注：與B組比較，*P＜0.05

組別A組（n=10）B組（n=10）C組（n=10）caspase 3（U/μg）69.76±3.35（51.48±2.47）*Bcl-2 0.53±0.18（0.84±0.23）*Bax 0.67±0.16（0.41±0.13）*

3 討論

從目前的研究文獻來看，心肌缺血預適應是獲得認可的一種效果最佳的心肌自我保護機制，對防止I/R損傷心肌有著積極的保護作用，其具體作用過程與機制涉及機體代謝的復雜生物活性物質，目前尚未完全清楚[7]。本研究以實驗大鼠為觀察對象，建立心肌缺血預適應模型，提取MVs，注射給心肌缺血在體處理大鼠，結果發現，MVs對大鼠心肌I/R損傷具有保護作用，能夠提高心肌組織中Bcl-2的表達水平，降低Bax表達水平，且下調caspase 3活性，從而起到心肌保護作用。

已有研究報道，以實驗大鼠為觀察對象，制作心臟I/R模型，采用灌流液中的MVs，對離體心臟進行處理，結果證實MVs具有保護心臟功能的作用[8]。本研究采用股靜脈注射MVs的方法，對心肌I/R模型大鼠進行處理，觀察血循環中MVs對在體大鼠I/R損傷的影響。心肌梗死面積是反映心臟組織受損嚴重程度最直觀的指標，也是評估治療I/R損傷是否有效的量化指標。本研究結果顯示，注射MVs能夠有效縮小I/R實驗大鼠的心肌梗死面積，未注射MVs的B組梗死區面積為（84.72±13.28）mg，高于經過注射MVs處理的C組的梗死區面積（67.21±11.37）mg（P＜0.05）。本研究中還同時檢測血清LDH，結果顯示，其變化趨勢與上述心梗面積的變化結果具有一致性。以上指標均表明，循環血中的MVs水平對I/R模型大鼠心肌損傷可起到積極保護作用。

心肌I/R損傷的整個過程中均可出現不同程度的細胞凋亡。有研究指出，MVs能夠發揮有抗凋亡作用[9]。王藝璐等[10]研究將大鼠隨機分為假手術組，I/R損傷組及I/R+MVs處理組，結果發現，I/R+MVs處理組的心肌細胞凋亡比例為28.73%，低于未經MVs處理的I/R損傷組心肌細胞凋亡比例（40.68%）（P＜0.01）。本研究在發現循環血中的MVs可顯著降低I/R大鼠心肌損傷嚴重程度的基礎上，進一步觀察MVs對于心肌細胞凋亡的影響作用及具體機制。本研究采用TUNEL染色法，分別定性、定量進行心肌細胞凋亡檢測，結果顯示，注射MVs可有效減輕I/R實驗大鼠心肌細胞凋亡率[（32.94±1.48）% vs （18.68±1.53）%]，與王藝璐等[10]報道基本一致。這進一步證實，MVs可通過抑制心肌細胞凋亡，從而發揮心肌保護功能。

Caspase 3是caspase級聯反應過程中的重要一環，在影響細胞凋亡中扮演關鍵角色[11]。已有研究報道，從多能干細胞中提取MVs，可有效抑制小鼠I/R心肌組織中的Caspase 3水平，從而起到抑制細胞凋亡的作用[12]。本研究中檢測了心肌組織caspase 3，實驗大鼠在遭受心肌I/R損傷后，caspase3活性水平明顯升高，通過注射MVs進行處理，可降低caspase升高幅度，這一結果提示，抑制caspase3的表達水平可能是Mvs抑制心肌細胞凋亡的重要機制之一。

已有研究證實，Bel家族蛋白的表達水平與心肌細胞凋亡程度存在密切相關。Bcl家族包括兩種具有拮抗功能的蛋白質，分別起著加速與抑制細胞凋亡的作用。此兩種蛋白的表達水平和功能狀態之間保持平衡是機體調控細胞凋亡的關鍵機制。有研究發現，大鼠發生心肌I/R損傷過程中，Bcl-2蛋白活性下調，Bax蛋白活性升高，Bcl-2／Bax比值呈現顯著下降趨勢[13]。對I/R大鼠進行心肌缺血預處理，能夠顯著上調Bcl-2蛋白水平，從而起到抑制細胞凋亡作用[14]。另有研究指出，從人T淋巴細胞中提取的Mvs能夠使Bcl-2活性升高、Bax表達水平降低，這對于由放射菌素D造成的內皮細胞凋亡具有拮抗作用[15]。本研究著重觀察MVs對I/R大鼠Bcl-2／Bax表達的影響情況。采用Western blot法檢測結果顯示，心肌I/R損傷發生后，實驗大鼠Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax表達顯著升高，經過MVs處理后，Bcl-2蛋白表達升高，I/R誘導的Bax蛋白降低。這可能是MVs抑制心肌細胞凋亡的另一重要機制。

綜上所述，對I/R大鼠注射MVs，可有效發揮心肌保護作用，其作用機制可能與上調Bcl-2蛋白表達，抑制Bax的蛋白水平，從而提高Bcl-2／Bax比值，以及降低caspase 3活性等有關。是否存在其他保護機制還需以后繼續深入探討。隨著對MVs研究的的重視，將為缺血性心臟病（ischemic heart disease， IHD）的治療方案的選擇提供新的參考依據。