RhaFGF局部外敷促進糖尿病大鼠難愈性皮膚潰瘍修復的研究

宋久于 王敏華 李海坤 廖寶春 陳小波 朱賢森 曾祥泰▲

1.贛南醫學院第二附屬醫院皮膚科，江西贛州 341000；2.贛南醫學院第一附屬醫院普外科，江西贛州 341000；3.贛南醫學院第二附屬醫院康復科，江西贛州 341000；4.贛南醫學院病理教研室，江西贛州 341000

糖尿病皮膚潰瘍是糖尿病患者截肢的主要原因，該病致殘率和致死率高，且治療愈合后容易復發。糖尿病皮膚潰瘍是因糖尿病引起的內環境改變（如高血糖、糖尿病性血管病變和神經病變）和由糖尿病引起的皮膚局部病理變化（如傷口感染、愈傷組織形成和創傷性應激）共同作用產生的嚴重并發癥。約有70%的2 型糖尿病患者將會發生外周神經病變[1]，使下肢和足底肌肉群萎縮無力，足弓力學失衡致跖骨壓力明顯增高，最終導致糖尿病足難愈性潰瘍的發生[2-3]。糖尿病潰瘍患者的皮膚經常摩擦衣物或鞋子等，加劇感染，導致異常疼痛[4-5]，給患者帶來巨大的痛苦。因此，有必要依據其發病機制，探索更安全、更有效的治療方法。

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，FGF）是人體活性蛋白的一種微量元素，分為酸性成纖維細胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），可調控一系列復雜的病理生理過程[6]。aFGF可誘導不同細胞的分化和增殖，誘導缺血區域的血管形成[7]，并增強肉芽組織的形成[8]，目前已成為創面修復領域的熱點。在糖尿病難愈性潰瘍初期，巨噬細胞和受損部分的內皮細胞釋放aFGF，刺激成纖維細胞和角質形成細胞的增殖，從而誘導產生蛋白酶、膠原酶和各種細胞因子[9]。有學者對深Ⅱ度燒傷糖尿病大鼠模型進行HE 染色，結果顯示aFGF 組細胞增殖明顯高于糖尿病組[10]。目前利用基因工程技術研發的一類新藥重組人酸性成纖維細胞生長因子（recombinant human acidic fibroblast growth factor，RhaFGF）已經在臨床上用于糖尿病潰瘍治療，其臨床效果正在被越來越多的臨床數據所證實[11]。本研究旨在通過生化分析、組織病理學及免疫熒光的方法，探究RhaFGF 對糖尿病大鼠難愈性皮膚潰瘍愈合的影響，并進一步研究其修復作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

于2020年2月至4月選取30 只健康雄性2月齡SPF 級SD 大鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），體重180～200 g。本研究經贛南醫學院第二附屬醫院倫理委員會審核批準。

1.2 藥品與試劑

鏈脲霉素（streptozotocin，STZ）購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Ki-67 抗體，CD31 抗體和HRP 標記山羊抗小鼠抗體購自北京生物科技有限公司；RhaFGF（商品名：艾夫吉夫）購自上海騰瑞制藥有限公司。

1.3 糖尿病大鼠潰瘍模型的制備

取30 只大鼠高脂高糖飼料（1.5%膽固醇、0.25%膽酸鈉、10%豬油、5%蔗糖、83.25%基礎飼料）喂養4周后，禁食過夜（不禁水）12 h 后在其腹腔注射STZ（35 mg/kg），5 d 后血糖≥11.1 mmol/L 為造模成功[12]。存活糖尿病大鼠用10%水合氯醛麻醉后，背部剃毛進行常規消毒，在其背部用龍膽紫標記兩等大圓形區域，總面積約為3.14 cm2。以外科手術剪小心沿標記處剪去全層皮膚，深至筋膜。8 h 后大鼠背部創面無感染、紅腫，大鼠活動能力、生命體征正常為造模成功[12]。造模成功后的糖尿病潰瘍模型在SPF 級動物環境飼養（其中2 只大鼠造模未成功）。

1.4 大鼠分組與給藥

造模成功的28 只糖尿病潰瘍大鼠編號后根據隨機數字表法分為RhaFGF 組和對照組，每組14 只。兩組大鼠的體重、潰瘍面積比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。RhaFGF 組給予RhaFGF 100 U/cm2局部外敷治療，對照組給予0.9%氯化鈉溶液0.1 ml/cm2局部外敷治療。

1.5 評估傷口愈合指標及方法

分別于給藥治療后的第7、14 天進行拍照（拍照使用5 cm 焦距1 倍視野）及收集皮膚潰瘍樣本，使用Image-J 軟件處理拍照圖片計算創面潰瘍面積，運用SOD、MDA 試劑盒在酶標記法檢測SOD、MDA 的絕對含量，HE 染色病理學觀察，免疫熒光檢測CD31 及Ki-67 表達的組織細胞陽性顆粒數并采用HPIAS-100 分析系統計算其陽性表達率。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，符合正態分布且方差齊的計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組潰瘍創面面積的比較

治療前，兩組的潰瘍創面面積比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療第7、14 天，兩組的潰瘍創面面積均小于治療前，RhaFGF 組的潰瘍創面面積小于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療第14 天，兩組的潰瘍創面面積均小于治療第7 天，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組潰瘍創面面積的比較（cm2，±s）

表1 兩組潰瘍創面面積的比較（cm2，±s）

對照組RhaFGF 組t 值P 值14 14 3.138±0.142 3.127±0.098 1.053＞0.05 1.590±0.099 1.204±0.021 5.437＜0.05 0.792±0.035 0.509±0.012 5.039＜0.05 7.063 7.963＜0.01＜0.01 8.459 8.834＜0.01＜0.01 6.495 6.073＜0.01＜0.01組別 例數 治療前 治療第7 天 治療第14 天 t 治療前與治療第7 天比較值P 治療前與治療第7 天比較值t 治療前與治療第14 天比較值P 治療前與治療第14 天比較值t 治療第7 天與治療第14 天比較值P 治療第7 天與治療第14 天比較值

2.2 兩組SOD 活性和MDA 含量的比較

治療第7、14 天，RhaFGF 組的MDA 含量低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；RhaFGF 組的SOD活性高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療第14 天，RhaFGF 組的MDA 含量低于本組治療第7天，SOD 活性高于本組治療第7 天，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組的MDA 含量、SOD 活性高于本組治療第7 天，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2～3）。

表2 兩組大鼠MDA 含量的比較（nmol/mg，±s）

表2 兩組大鼠MDA 含量的比較（nmol/mg，±s）

對照組RhaFGF 組t 值P 值14 14 0.50±0.05 0.38±0.04 4.517＜0.05 0.65±0.17 0.19±0.04 5.314＜0.05 3.623 5.764＜0.05＜0.05組別 例數 治療第7 天 治療第14 天 t 值 P 值

表3 兩組大鼠SOD 活性的比較（U/mg，±s）

表3 兩組大鼠SOD 活性的比較（U/mg，±s）

對照組RhaFGF 組t 值P 值14 14 0.08±0.09 0.19±0.01 4.843＜0.05 0.18±0.08 0.32±0.09 5.364＜0.05 3.342 5.343＜0.05＜0.05組別 例數 治療第7 天 治療第14 天 t 值 P 值

2.3 兩組CD31、Ki-67 陽性表達率的比較

治療第7、14 天，RhaFGF 組的CD31、Ki-67 陽性表達率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；治療第14 天，兩組的CD31、Ki-67 陽性表達率高于本組治療第7 天，差異有統計學意義（P＜0.05）（表4～5）。

表4 兩組大鼠CD31 陽性表達率的比較（%，±s）

表4 兩組大鼠CD31 陽性表達率的比較（%，±s）

對照組RhaFGF 組t 值P 值14 14 7.33±2.17 20.13±3.78 7.306＜0.01 13.70±2.54 29.54±6.35 6.551＜0.01 6.327 7.154＜0.01＜0.01組別 例數 治療第7 天 治療第14 天 t 值 P 值

表5 兩組大鼠Ki-67 陽性表達率的比較（%，±s）

表5 兩組大鼠Ki-67 陽性表達率的比較（%，±s）

對照組RhaFGF 組t 值P 值14 14 6.27±1.53 20.79±10.79 6.768＜0.01 10.73±2.54 36.95±8.25 7.591＜0.01 5.327 7.954＜0.05＜0.01組別 例數 治療第7 天 治療第14 天 t 值 P 值

2.4 組織病理學檢查結果

分別在第7、14 天取兩組大鼠潰瘍組織進行HE染色，每個觀察時間點取4 張切片，在每張切片中隨機選取4 個高倍視野；40 倍鏡下完成計數。結果見圖1（封四），第7 天對照組大鼠有大量的炎癥細胞浸潤，只有少量的成纖維細胞和新生的毛細血管，而RhaFGF 組新生的毛細血管、成纖維細胞數量和膠原蛋白表達量明顯增加。第14 天RhaFGF 組發現有大量的毛細血管、成纖維細胞和膠原蛋白在潰瘍邊緣形成，再上皮化水平及成纖維細胞數量明顯高于對照組。

3 討論

糖尿病皮膚潰瘍的修復是一個復雜的生物學過程，包含創面氧化應激炎癥反應、肉芽組織增生和再上皮化等方面，受多種細胞因子參與及調控。FGF 是一種能促使細胞增殖的蛋白質因子家族，具有促進細胞增殖和分裂的功能，調控血管生成、創傷修復等過程[13]。MDA 是脂質過氧化的最終產物；SOD 是一種生物活性物質，可以消除代謝產物。本研究結果顯示，使用RhaFGF 可以減少皮膚潰瘍處的MDA 含量，提高SOD 的活性，有效減輕糖尿病皮膚潰瘍的氧化應激帶來的損傷程度，提示RhaFGF 可促進糖尿病大鼠難愈性皮膚潰瘍的修復。

新生毛細血管可改善傷口微循環，為組織修復提供氧氣和營養，促進潰瘍創面的愈合[14]。成纖維細胞是傷口修復的主要細胞，在潰瘍形成后合成和分泌足夠的膠原蛋白和細胞外基質成分，參與肉芽組織增生、創面愈合和組織再生過程[15]。HE 染色結果顯示，RhaFGF 組與糖尿病組比較，新生的毛細血管、成纖維細胞的含量以及膠原蛋白的表達量顯著增加，提示RhaFGF 通過誘導血管分化、增加新生毛細血管的數量改善潰瘍創面微循環，為其提供氧氣和營養物質，促進潰瘍創面修復。

RhaFGF 通過增強CD31 和Ki-67 增殖蛋白的表達，可以促進成纖維細胞的增殖。CD31 是一種表達于造血細胞和內皮細胞表面的130-kD 的糖蛋白，是一種細胞黏附分子[16]，CD31 分子的密集程度可以反映新生血管的密集程度，表達量與細胞增殖密切相關[17]。Ki-67 是一種增殖細胞相關的核抗原，其功能與細胞有絲分裂密切相關。導致糖尿病足潰瘍創面難愈的主要原因在于創面肉芽組織中細胞成分增殖不足和過度氧化應激[18-19]。本研究結果顯示，RhaFGF 可促進CD31 和Ki-67 的釋放，增強成纖維細胞增殖和膠原蛋白表達。

綜上所述，RhaFGF 通過促進糖尿病難愈性潰瘍的氧化應激、增加潰瘍組織的毛細血管和成纖維細胞生成提高上皮再生水平，從而促進大鼠糖尿病潰瘍組織的修復。