紅參調控DARS-AS1/miR-125a-5p通路對人血管平滑肌細胞生物學過程的影響

黃達民，張金春，宋 蕾，岳冬梅，劉洪強，盧英民

動脈粥樣硬化是促使心腦血管疾病發生的重要病理基礎之一，動脈粥樣硬化的發生率逐年升高，研究顯示，血管平滑肌細胞增殖、遷移及炎癥反應與動脈粥樣硬化密切相關[1-2]。因而，積極探尋調控血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲的有效藥物對心腦血管疾病的治療具有重要意義。同型半胱氨酸(Hcy)可誘導血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲從而促進動脈粥樣硬化的發生，因此，常采用Hcy誘導血管平滑肌細胞建立模型[3]。紅參(red ginseng，RG)具有抗氧化作用，從而可減緩多種疾病的發展進程[4]。但紅參對血管平滑肌細胞損傷的作用機制尚未明確。長鏈非編碼RNA DARS-AS1(LncRNA DARS-AS1)在甲狀腺癌等腫瘤中表達上調，并可促進腫瘤的發生及發展[5]。但DARS-AS1對血管平滑肌細胞損傷的作用機制尚未闡明。生物信息學分析顯示，微小RNA-125a-5p(miR-125a-5p)可能是DARS-AS1的靶基因，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的人血管平滑肌細胞中miR-125a-5p的表達下調，上調其表達可通過靶向調控(NLRP3)的表達從而抑制細胞增殖[6]。但紅參是否可通過調控DARS-AS1/miR-125a-5p通路而影響血管平滑肌細胞生物學行為尚未可知。因此，本研究采用Hcy處理人血管平滑肌細胞，探討紅參對細胞增殖、遷移及侵襲的影響，探究其對DARS-AS1/miR-125a-5p通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 紅參購自上海齊一生物公司；人血管平滑肌細胞購自美國ATCC公司；Hcy與四唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司；反轉錄與熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；DARS-AS1小分子干擾RNA(DARS-AS1 siRNA，si-DARS-AS1)、siRNA陰性序列(si-NC)、miR-125a-5p mimics及mimic 陰性序列(miR-NC)購自廣州銳博生物公司；pcDNA3.1購自上海柯雷生物公司；兔抗人CyclinD1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21抗體購自美國CST公司；二抗購自美國Abcam公司。

1.2 實驗分組 ①紅參提取液[7]：稱量3 g紅參樣品，磨碎，加入20 mL水，超聲提取30 min，室溫條件下10 000 r/min離心10 min，收集3次提取液，使用0.22 μm濾膜過濾，加入培養基稀釋成濃度5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的溶液。②血管平滑肌細胞接種于6孔板(5×104個/孔)，分別加入含有500 μmol/L Hcy的培養基處理24 h[8]，作為Hcy組。同時將正常培養的細胞作為Control組。分別加入含有5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的紅參提取液與500 μmol/L Hcy的培養基處理24 h，分別作為Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組。后續實驗設置Hcy+si-NC組(si-NC轉染至血管平滑肌細胞，加入含有濃度為500 μmol/L Hcy的培養基處理24 h)、Hcy+si-DARS-AS1組(si-DARS-AS1轉染至血管平滑肌細胞，加入含有濃度為500 μmol/L Hcy的培養基處理24 h)、Hcy+RG-H+pcDNA組(pcDNA轉染至血管平滑肌細胞，加入含有濃度為20 mg/mL 紅參提取液與500 μmol/L Hcy的培養基處理24 h)、Hcy+RG-H+pcDNA-DARS-AS1組(pcDNA-DARS-AS1轉染至血管平滑肌細胞，加入含有濃度為20 mg/mL 紅參提取液與500 μmol/L Hcy的培養基處理24 h)。

1.3 觀察指標檢測

1.3.1 MTT法檢測細胞增殖情況 在96孔板上接種血管平滑肌細胞(1×104個/孔)，按照MTT試劑盒說明書操作并檢測細胞OD值。

1.3.2 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲情況 在Transwell小室(美國Corning公司)下室加入600 μL含有10%胎牛血清的培養液；Matrigel基質膠包被(侵襲實驗，遷移實驗無需包被)上室后加入血管平滑肌細胞懸浮液150 μL，培養24 h后依次以多聚甲醛、0.1%結晶紫染液固定20 min、染色10 min，于顯微鏡下觀察透過膜的血管平滑肌細胞數。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測細胞中DARS-AS1、miR-125a-5p表達水平 用1 mL Trizol裂解液提取血管平滑肌細胞中總RNA，按反轉錄試劑盒的說明進行RNA反轉錄，合成cDNA。qRT-PCR反應在StepOne Plus Real-time PCR系統上按照熒光定量PCR試劑說明書操作，通過2-ΔΔCt法計算DARS-AS1、miR-125a-5p表達。引物由上海生工公司制備。

1.3.4 雙熒光素酶報告基因檢測DARS-AS1與miR-125a-5p的靶向關系 構建野生型載體WT-DARS-AS1與突變型載體MUT-DARS-AS1，分別將miR-NC、miR-125a-5p mimics與WT-DARS-AS1、MUT-DARS-AS1共轉染至血管平滑肌細胞，24 h后在雙熒光素酶報告分析系統中測量血管平滑肌細胞的相對熒光素酶活性。

1.3.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達 血管平滑肌細胞在蛋白裂解液中裂解，等量蛋白用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離，隨后將分離的蛋白凝膠轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，分別加入兔抗人CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21一抗稀釋液(均為1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，條帶使用增強化學發光法可視化后用Image J軟件分析。

2 結 果

2.1 紅參抑制Hcy誘導的人血管平滑肌細胞增殖 與Control組比較，Hcy組細胞增殖率和CyclinD1蛋白水平升高，p21蛋白水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與Hcy組比較，Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組細胞增殖率和CyclinD1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，且Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 Western Blot法檢測CyclinD1、p21蛋白表達條帶圖

表1 紅參抑制Hcy誘導的人血管平滑肌細胞增殖 (±s)

2.2 紅參抑制Hcy誘導的人血管平滑肌細胞遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9蛋白表達 與Control組比較，Hcy組遷移及侵襲細胞數、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與Hcy組比較，Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組遷移、侵襲細胞數、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，且Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2、圖2、圖3。

表2 紅參抑制Hcy誘導的人血管平滑肌細胞遷移及侵襲 (±s)

圖2 紅參抑制Hcy誘導的人血管平滑肌細胞遷移及侵襲圖

圖3 各組MMP-2、MMP-9蛋白表達條帶圖

2.3 紅參調控DARS-AS1、miR-125a-5p的表達 與Control組比較，Hcy組DARS-AS1的表達水平升高，miR-125a-5p的表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與Hcy組比較，Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組DARS-AS1的表達水平降低，miR-125a-5p的表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，且Hcy+RG-L組、Hcy+RG-M組、Hcy+RG-H組組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 紅參調控DARS-AS1、miR-125a-5p的表達 (±s)

2.4 干擾DARS-AS1表達抑制Hcy誘導的人血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲 Hcy+si-DARS-AS1組細胞增殖率及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平，遷移細胞數，侵襲細胞數比Hcy+si-NC組減少，p21蛋白表達水平比Hcy+si-NC組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4、圖4。

表4 干擾DARS-AS1表達抑制Hcy誘導的人血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲及CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達比較 (±s)

圖4 干擾DARS-AS1表達后CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達條帶圖

2.5 DARS-AS1靶向調控miR-125a-5p DARS-AS1與miR-125a-5p存在結合位點，詳見圖5。miR-125a-5p過表達能夠降低WT-DARS-AS1的熒光素酶活性，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表5。DARS-AS1可負向調控miR-125a-5p的表達，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表6。

圖5 DARS-AS1與miR-125a-5p互補的核苷酸序列示意圖

表5 雙熒光素酶報告實驗(±s)

表6 DARS-AS1靶向調控miR-125a-5p的表達 (±s)

2.6 DARS-AS1過表達可減弱紅參對Hcy誘導的人血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用 Hcy+RG-H+pcDNA-DARS-AS1組細胞增殖率和CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平，遷移細胞數與襲細胞數高于Hcy+RG-H+pcDNA組，差異均有統計學意義(P<0.05)，p21蛋白、miR-125a-5p水平低于Hcy+RG-H+pcDNA組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖6、表7。

圖6 DARS-AS1靶向調控后CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達條帶圖

表7 DARS-AS1過表達可減弱紅參對Hcy誘導的人血管平滑肌細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用及調控CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達 (±s)

3 討 論

紅參在血管系統疾病等多種疾病中均具有一定治療作用，可通過促進一氧化氮(NO)的合成及釋放從而發揮舒張血管的作用[9]。紅參提取物中紅參皂苷還可抑制氧化應激反應從而保護神經細胞[10]。本研究結果顯示，Hcy處理后血管平滑肌細胞增殖能力增強，并可促進CyclinD1表達及抑制p21表達，而不同濃度的紅參處理后血管平滑肌細胞增殖能力降低，并可抑制CyclinD1表達及促進p21表達。研究表明，下調CyclinD1表達及上調p21表達可抑制血管平滑肌細胞增殖[11]，提示紅參可抑制Hcy誘導的血管平滑肌細胞增殖，且呈劑量依賴性。血管平滑肌細胞遷移及侵襲與MMP-2、MMP-9表達密切相關[12]。本研究結果顯示，Hcy處理后可促進細胞遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9表達，而不同濃度的紅參可抑制細胞遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9的表達。

本研究結果顯示，Hcy誘導的血管平滑肌細胞中DARS-AS1的表達水平明顯升高，而不同濃度的紅參處理后DARS-AS1的表達水平明顯降低，提示紅參可能通過調控DARS-AS1的表達從而影響血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲。研究指出，DARS-AS1在卵巢癌中表達水平升高，并可能通過靶向調控miR-532-3p從而促進卵巢癌的發生及發展[13]。本研究結果顯示，干擾DARS-AS1的表達使Hcy誘導的血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲能力減弱，提示DARS-AS1可促進Hcy誘導的血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲。本研究證實DARS-AS1可靶向結合miR-125a-5p。Hcy誘導的血管平滑肌細胞中miR-125a-5p的表達水平降低，而不同濃度的紅參處理后miR-125a-5p的表達水平升高，提示紅參可能通過上調miR-125a-5p的表達從而參與動脈粥樣硬化的發生過程。研究表明，干擾LnRNA MEG3 表達可能通過上調miR-125a-5p 的表達從而抑制血管平滑肌細胞的增殖[14]。miR-125a-5p通過靶向ETS-1調節血管平滑肌細胞的表型轉換[15]，提示紅參可能通過下調DARS-AS1的表達靶向調控miR-125a-5p來調節血管平滑肌細胞的生物學過程。

綜上所述，紅參可抑制Hcy誘導的血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲，其作用機制與下調DARS-AS1的表達及上調miR-125a-5p的表達有關，DARS-AS1過表達可逆轉紅參對Hcy誘導的血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲的作用，進一步證實紅參是通過抑制DARS-AS1而促進miR-125a-5p的表達來發揮作用，DARS-AS1可能為動脈粥樣硬化治療的潛在靶點，本研究為進一步闡釋紅參治療動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的作用機制奠定了一定的實驗基礎。