公共實驗平臺細胞培養室污染風險分析和管理措施

楊迷芳，江宏兵，潘永初，王 林

（1.江蘇省口腔疾病研究重點實驗室，江蘇 南京 210029；2.南京醫科大學附屬口腔醫院，江蘇 南京 210029）

江蘇省口腔疾病研究重點實驗室成立于2004年，是江蘇省內首家具有較大規模、較高檔次、開展項目較全的口腔醫學研究公共實驗平臺，隸屬于南京醫科大學和江蘇省口腔醫院，是院校共建的公共實驗平臺。實驗室自成立以來，本著資源共享、優化配置和集約化管理的原則，充分整合空間資源、儀器設備資源和管理隊伍資源，避免了儀器設備的重復購置，提高了實驗資源的利用率，以最小的投入獲取最大的利益，集約化管理是我們實驗平臺實現高速發展的保障[1-2]。經過17年的發展，本公共實驗平臺的細胞培養室總面積接近200平方米，擁有20臺生物安全柜，25臺細胞培養箱，可以同時為20名師生的細胞培養提供場地和配套儀器設備。平均每天有約150名師生利用該室進行與細胞培養有關的科研工作。集約化的管理帶給我們高速發展和便利化管理的同時，細胞污染也成為本平臺細胞培養室最大的威脅，細胞污染一旦蔓延開來，勢必造成更大的不可挽回的損失，需要投入更多的時間，更大的人力、物力進行治理。因此預防和避免細胞污染是成為本平臺細胞培養室管理的第一要務。我們作為如此大型的公共細胞培養室的管理者，總結了多年的管理經驗，從細胞培養室的建設布局、制度管理、儀器管理、人員管理及操作管理的角度，分析公共實驗平臺的細胞培養室特有的污染風險因素以及控制策略，希望為該類實驗室管理工作提供參考，促進該類實驗室管理工作更好的發展。

1 細胞培養室選址和布局

在本公共實驗平臺建設過程中，細胞培養室從早期的20平方米經歷多次擴建，才慢慢發展到如今的200平方米。由于建設時間跨度大，細胞培養室的整個建設過程缺少統一的規劃設計，而且細胞培養室的場地是由20世紀50年代的辦公場地改建而來，房屋本身承重有限，無法安裝潔凈設備，目前僅有紫外滅菌燈和空氣消毒機，無法保證細胞培養室內環境的潔凈要求。另外，由于房屋結構無法改變，細胞培養室布局結構并不合理，導致無菌操作設備、孵育設備和樣本制備等設備混放在一起，實驗人員在使用過程中，常常在各實驗設備中來回穿插，造成相互之間交叉干擾。這些選址和布局方面造成的影響，從根本上增加了細胞培養室的管理難度。

在醫院的十四五發展規劃中，細胞培養室的建設是實驗室發展規劃的重點項目之一，在新的建設規劃中，我們將選址、房屋結構作為重點因素，從規劃設計上，徹底改變細胞培養室管理的潛在風險。在新的細胞培養室的設計規劃中，我們將細胞培養實驗室分為無菌操作區、孵育區、制備區、儲藏區、清洗和消毒滅菌區六部分。同時，這些區域的共同要求是房間要寬敞明亮，地面要便于清潔、防滑，墻壁的質地光滑堅硬，儀器設備布局合理、方便操作。細胞培養室還規劃有獨立的空氣潔凈系統，以保證細胞培養室的溫度、濕度和潔凈度。細胞培養室各區合理布局，面積大小適中，要求同時在細胞培養間操作的人數不能超過4人，從根本上降低細胞培養室環境污染的風險[3-4]。

2 細胞培養室管理辦法

近年來，隨著本平臺細胞培養室規模不斷擴大，使用人數也不斷攀升，使用人員日趨復雜，在細胞培養過程中出現的問題也逐漸多樣化。而早期制定的細胞培養室管理辦法，大多從網上照搬過來，這些條例內容大多相似，而且僅強調無菌操作區規范，忽略了人員進出、物品進出、物品擺放、培養箱的使用、實驗垃圾的處理等各個環節的規章制度建設，造成管理制度與實際管理脫節，無法保證細胞培養室的有序進行。

圖1 細胞培養室布局示意圖

針對以上問題，我們在管理過程中，我們收集了在管理中，經常出現的問題，并深入分析問題的本質，進而細化出相應的規章制度，從而制定出了針對性強、涵蓋面廣、流程化、可操作的管理辦法，從根源上減少導致細胞污染事件的發生。我們分別制定了《細胞培養室人員進出制度》《細胞培養室物品進出和擺放制度》《細胞培養實驗操作步驟》《細胞培養室廢棄物處理制度》《細胞培養室儀器設備使用和維護管理制度》《細胞培養室突發應急事件管理條例》《細胞培養室違規行為處罰條例》等針對細胞培養過程全流程的管理辦法，并將重要的注意事項制作成展板或卡片張貼在醒目位置，提醒實驗人員規范操作。細胞培養室的管理從粗放到逐步完善的精細化管理，增強了研究生的規范意識，減少了細胞培養室污染的潛在風險[5-7]。

3 培訓與考核

本平臺細胞培養室作為公共實驗平臺，對本院所有學科的師生開放，同時還接收兄弟院校師生的申請。目前，每年使用培養室登記在冊約150人，其中80%為碩士研究生，他們來自不同的專業和年級，其中90%學生在進入實驗室之前，對細胞培養室規章制度缺乏了解，對細胞培養技術知之甚少，對操作技術的掌握幾乎為零。本平臺細胞培養室在管理初期，僅針對初入細胞培養室的學生進行規章制度以及具體的實驗操作進行系統培訓，通過培訓考核后即可進入細胞培養室操作。由于訓練的時間較短，很多初入實驗室的學生對細胞培養技術掌握并不牢固，往往會跟著課題組內的師兄、師姐繼續練習。而部分師兄、師姐由于長時間的操作后，對細胞培養室的規章制度、操作流程往往持麻木態度，逐漸出現懈怠思想，在操作細節上逐漸出現問題，比如：進出細胞房不穿鞋套、實驗操作時不戴手套、實驗前后不消毒安全柜臺面等。這種高年級學生帶低年級學生的“幫、傳、帶”傳授方法，往往存在錯誤示范，循環往復之下，實驗室的污染風險更加嚴重。而且，這種由于操作行為引起的污染，往往會造成整個培養室環境的污染，卻難以尋找污染的源頭。因此，在細胞培養室管理制度中，增加系統的規章制度培訓和細胞培養技術操作培訓的頻次，并且加強現場巡查指導和糾錯機制必不可少[8]。

針對此情況，本平臺細胞培養室，制定了以下培訓和考核制度。培訓方式包括PPT學習和現場操作培訓。我們將細胞培養室培訓內容制作成PPT課件供申請者網上學習，并根據PPT培訓內容建立考試題庫。PPT培訓內容包括細胞培養室人員進出、物品進出、實驗操作步驟、儀器設備使用維護管理、物品存儲管理、實驗突發情況管理、違規處罰等全流程的規章制度，以及儀器設備使用方法和細胞培養操作步驟。現場操作部分由管理老師現場帶教，實驗人員現場實操，直到學會獨立操作為止。本平臺每月組織一次考核，線上題庫和現場操作考核全部通過后，方可進入細胞培養室開展實驗。題庫考核和現場實操考核結果不合格者，必須重新進行培訓，并再一次進行考核，直到完全通過考試。另外，管理老師每天巡查細胞培養室內學生現場操作，發現違規行為及時糾錯，并將違規行為記錄在冊，建立違規操作名冊，按照處罰條例進行處理，違規積累超過三次者，將重新參加培訓和考核。通過以上培訓、考核和現場巡查制度，促使師生養成規范操作的習慣，極大地減少了污染率（見圖2，P52）。

圖2 人員培訓流程圖

4 儀器設備檢驗維護

本平臺細胞培養室共分為三個小型細胞培養室，每個細胞培養室內平均配備8臺細胞培養箱、7臺生物安全柜、2顯微鏡、2臺離心機、1臺細胞計數儀、4臺冰箱、2臺渦旋儀等，每個細胞培養室約50人使用。細胞培養箱按照課題組進行分組，每層固定人員使用，生物安全柜按照時段預約排隊使用。據統計，細胞培養箱每小時至少有1次開關記錄，生物安全柜每天至少8人次預約使用，冰箱、顯微鏡、離心機、細胞計數儀等設備開關次數更是不計其數，這些儀器設備在使用過程中，如此高頻次的與不同細胞系和不同操作者接觸，逐漸成了細胞培養室內潛在的污染因素的“溫床”。在管理初期，細胞培養室內儀器設備由于缺乏全面性管理手段，常常由學生自己負責對設備進行維護管理，儀器設備消殺檢驗和維護更新更是不及時，一旦發生污染，將會引起快速蔓延。

針對此情況，我們廣泛收集細胞培養室儀器管理方法的技術資料，認真學習，結合本室的實際情況整理匯總，制定出詳細的細胞培養室內儀器設備管理辦法[9-10]。例如：細胞培養箱箱體和附件每月用75%酒精噴灑內腔清潔消毒，每六個月進行一次箱內的高溫滅菌；培養箱內增濕水盤每周使用75%酒精噴灑消毒一次，并更換水盤內的蒸餾水，同時按比例添加抑菌劑；開關培養箱取用細胞時，先用75%酒精消毒雙手，再打開培養箱的門，取出的細胞培養皿或細胞培養箱先用75%酒精噴灑表面，再進行下一步操作；使用顯微鏡時，先用酒精噴灑載物臺，再將細胞放到載物臺上進行觀察；顯微鏡的鏡頭每周使用吸耳球清潔一次，注意不要用水擦試鏡頭，避免鏡頭表面殘留水跡，可能滋生霉菌，損壞顯微鏡并引起污染；使用生物安全柜前后，均需使用75%酒精擦拭清潔表面，避免交叉污染；每半年清潔一次生物安全柜的底部和內腔表面，清除底部和內腔表面的拋灑物；定期更換生物安全柜內的紫外消毒燈；冰箱門表面、離心機內腔、細胞計數儀、渦旋儀等設備，每天使用75%酒精進行兩次表面消毒。通過這些儀器設備維護舉措，有效降低了儀器設備帶來的污染隱患[11]。

5 污染事件上報處理

目前，本平臺細胞培養實驗中常用的培養器皿有培養瓶、圓底細胞培養皿和方底細胞培養板，不管是哪種培養器皿，由于其體積較小，邊緣光滑，在從細胞培養箱中拿取時，稍不注意，都會有打翻或滑落的情況發生。加上本實驗室培養箱資源緊張，每個培養箱中的培養器皿都是多層疊放，在拿取時，更是經常發生打翻的情況。培養器皿一旦打翻或滑落，就會造成細胞和培養液的拋灑，拋撒的細胞和培養液會污染細胞培養箱的層板、水盤和其他學生的細胞樣本。在早期實驗室管理制度中，由于缺乏明確的污染事件上報流程和處理機制，導致學生不主動上報，管理老師對污染事件不知情，不能對污染事件作出分析和評估，更沒有及時的處理措施。此時，沾染有拋灑液體的培養箱擱架、水盤和已經污染的細胞就會成為新的污染源，導致污染擴散，給更多的師生的實驗研究造成難以估量的損失。

針對上述情況，本平臺細胞培養室制定了嚴格的污染上報流程和處理措施。首先管理老師制作了《污染事件上報調查表》，表格中內容包含污染發生日期、使用細胞培養箱位置、污染事件描述、細胞類型、污染時細胞形態變化，課題組內實驗物品共用情況等，本調查表每周下發給學生，并要求所有使用細胞培養室人員參與調查。除定期調查污染事件以外，學生在實驗過程中如有緊急污染事件發生，也可隨時填寫本表，進行上報。管理老師根據每周上報的情況，分析細胞污染原因，針對性作出處理方案，處理方案執行結束后進行回訪，形成一個閉環管理。通過以上上報機制和處理機制，大大提高了細胞污染事件的處理效率，有效避免了大規模污染事件的發生。

圖3 污染事件處理流程圖

6 結語

本公共實驗平臺自成立以來，在南京醫科大學和江蘇省口腔醫院的大力支持下，不斷地加強建設，引進了很多先進實驗設備，硬件設施處于全省前列，本平臺為院校科研事業的高速發展作出了巨大的貢獻。但是，本公共實驗平臺的管理模式，相對于世界其他發達國家還比較落后，還存在很多問題有待解決，為了縮短落后距離，跟上時代步伐，我們的管理模式必須進行探索和改革[12]。細胞培養室作為本公共實驗平臺中至關重要的一部分，更應發揮其管理模式的先鋒作用。我們作為一線的細胞培養室的主要管理者，應始終堅持以問題為導向，主動深入分析和思考，勇于改革創新，探索出一條有自己特色的管理模式，為院校的科研事業提供堅實的保障。