霍山鐵皮石斛糖蛋白提取方法對比研究

祝啟張 劉莉彬 崔紹進 劉慶慧 寧克壯 陳文正 張寧磊 鄧輝

摘 要：為研究霍山鐵皮石斛糖蛋白的功效，以霍山鐵皮石斛鮮莖為試驗材料，比較鹽溶液浸提和水提醇沉2種方法提取糖蛋白的效果。鹽（NaCl）溶液浸提條件為：提取溫度4℃、濃度0.3mol/L、料液比1∶16、提取時間24h，提取液經硫酸銨分級（15%、35%、60%）沉淀，去離子水透析脫鹽后，再經聚乙二醇濃縮得糖蛋白提取液。水提醇沉提取條件：65℃水浴浸提，浸提3次，每次3h，對鐵皮石斛進行浸提得提取液，加不同濃度（50%、70%、90%）乙醇進行沉淀得糖蛋白粗品，經去離子水復溶得糖蛋白溶液。2種方法所得的提取產物用SDS-PAGE電泳，再經蛋白染色和糖染色，確定并對比糖蛋白條帶。結果表明：鹽溶液浸提法獲得的糖蛋白條帶在濃度、數量和分子量范圍上都顯著高于水提醇沉法。試驗結果為進一步開展霍山鐵皮石斛糖蛋白的活性研究奠定了基礎。

關鍵詞：霍山鐵皮石斛;糖蛋白;提取方法

中圖分類號 TS201.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）02-0024-03

Abstract： For the study of Mount Holyoke Dendrobium glycoprotein efficacy experiment on Mount Holyoke Dendrobium as experimental materials， according to the glycoprotein extraction effect， comparative study of “salt leaching glycoprotein” and “water extraction and alcohol precipitation of glycoprotein” two methods. Salt （NaCl） solution extraction conditions： extraction temperature of 4 DEG C， the concentration of 0.3mol/L， solid-liquid ratio 1∶16， extraction time 24h， extract by ammonium sulfate （15%， 35%， 60%） precipitation， deionized water purified by polyethylene glycol， concentrating glycoprotein extract. Water extract alcohol extraction conditions： 65 DEG C water bath extraction， extraction three times， each time 3h， extract of Dendrobium officinale extract liquid with different concentrations （50%， 70%， 90%） ethanol precipitated crude glycoprotein， dissolved by deionized water to glycoprotein solution. The products were identified by 12%SDS-PAGE electrophoresis， and then stained and stained with glucose to determine and compare the glycoprotein bands. The results showed that the number and concentration of the glycoprotein bands obtained by salt solution extraction method were significantly higher than that of water extraction and alcohol precipitation method. The experimental results provide a basis for further research work activity of Dendrobium candidum glycoprotein in Mount Holyoke.

Key words： Mount Holyoke Dendrobium; Glycoprotein; Extraction method

霍山鐵皮石斛具有調節免疫、降血糖、抗腫瘤、降血脂、抗氧化等多種生物活性。植物糖蛋白是一類由寡糖鏈與肽鏈中以糖苷鍵共價連接而成的蛋白質，具有調節免疫、降血糖、抗腫瘤、降血脂、抗氧化等多種生理活性[1]。鐵皮石斛中的石斛多糖具有較強的藥理活性[2-5]。國內外學者對霍山鐵皮石斛有效成分的系統研究有很多，但多數專家學者的研究側重于總生物堿和多糖，而對于霍山鐵皮石斛糖蛋白的活性研究卻很少。糖蛋白在生物體內分布廣泛，是目前人類研究比較多的一種糖復合物。大部分天然蛋白質都帶有共價鍵相連的多糖側鏈，并且因其多種生理活性而在生物體中起著重要作用。若能分離鑒定出霍山鐵皮石斛的糖蛋白成分，就能為霍山鐵皮石斛糖蛋白的分離鑒定及其免疫調節活性的研究提供基礎數據，進而能進一步了解霍山鐵皮石斛的藥理藥效的基礎[6]。為此，本試驗根據糖蛋白的性質，設計了提取蛋白的鹽溶液浸法和提取多糖的水提醇沉法的2種糖蛋白提取方法，旨在探究2種提取方法提取霍山鐵皮石斛糖蛋白的效果。

1 材料與方法

1.1 儀器設備 電子天平（GL-20G-II，上海安亭科學儀器廠），電泳儀（北京白晶生物技術有限公司），海爾冰柜，ST 16R型高速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific），電泳儀（北京白晶生物技術有限公司），水浴鍋，磁力攪拌器，移液槍，搖床等。

1.2 材料和試劑

1.2.1 試驗材料 霍山鐵皮石斛、蛋白Marker、離心管。

1.2.2 試驗試劑與配制 （1）SDS-PAGE試劑配制：①30%丙烯酰胺：28g丙烯酰胺，1g N，N-亞雙丙烯酰胺蒸餾水定容至100mL。②分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8），18.15g Tris，HCl（市售濃度為11.6mol/L）2.2mL蒸餾水定容至100mL。③濃縮膠緩沖液：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8），12.1g Tris，HCl（市售濃度為11.6mol/L）調至pH6.8，HCl用量超過7.88mL，蒸餾水定容至100mL。④10%SDS：10g SDS用蒸餾水定容至100mL。⑤10%過硫酸銨：1g過硫酸銨加10mL水。⑥TEMED（用純品）。⑦電泳緩沖液（5×buffer）：15.1g Tris，72g Gly，5g SDS，定容至1000mL。⑧2×SDS-PAGE上樣緩沖液：1.0mol/L Tris-HCl pH6.8 10mL，巰基乙醇1.39mL，SDS 4g，溴酚藍0.2g，甘油20mL，定容止100mL。

（2）考馬斯亮藍染色試劑配制：①染色液：考馬斯亮藍R250 0.25g，甲醇45mL，冰醋酸10mL，ddH2O 45mL。②脫色液：225mL乙醇，35mL乙酸加蒸餾水定容至500mL。

（3）PSA染色試劑配制：①PAS染色液：Schiff試劑，先將100mL蒸餾水煮沸，然后加入0.5g堿性品紅，充分攪拌，必要時可再煮沸5min，使之充分溶解。待溶液冷卻至50℃時，過濾，向溶液中加入10mL 1mol/L HCl。冷卻至25℃時。加0.5g偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）蓋嚴，至于暗處，經幾天后紅色稍褪，溶液呈白或淡黃色。如果仍有紅色，可加活性炭0.25g搖1min，過濾，裝入棕色瓶并外包黑紙，放入冰箱中備用。②脫色液：225mL乙醇，35mL乙酸加蒸餾水定容至500mL。③0.5%偏重亞硫酸鈉：0.5g偏重亞硫酸鈉蒸餾水定容到100mL。

1.3 試驗方法與步驟

1.3.1 鹽溶液浸提糖蛋白 精確稱取10g新鮮霍山鐵皮石斛莖，剪碎，用160mL 1.3mol/L的NaCl溶液放入4℃冰箱浸提，過夜→過濾取上清液，進行硫酸銨分級沉淀。稱取26.24g硫酸銨緩慢加入（邊加邊攪拌）到上清液中，完全溶解，放入4℃冰箱，過夜→離心（4000r/min，40min），待離心結束，收集沉淀，向上清液中緩慢加入31.52g硫酸銨進行二級沉淀（邊加邊攪拌）溶解完全，4℃冰箱過夜→離心（4000r/min，40min），收集二級沉淀，向上清液中再加入38.72g硫酸銨（邊加邊攪拌）進行三級沉淀，不完全溶解，4℃冰箱過夜→離心（4000r/min，40min），收集三級沉淀→沉淀透析，取3個透析袋沸水煮10min，檢漏，后分別將一級、二級、三級所得到的粗糖蛋白提取液倒入3個透析袋中，兩頭扎緊，懸掛在裝滿去離子水的燒杯中，放到磁力攪拌器上進行透析，2h換1次水，換3次→濃縮，用聚乙二醇10000對透析袋中的糖蛋白提取液濃縮，濃縮30min，收集一、二、三級濃縮液到血清瓶中，貼好標簽，即得鹽溶液浸提糖蛋白提取濃縮液。

1.3.2 水提醇沉浸提糖蛋白[7-9] 精確稱取3份10g新鮮霍山鐵皮石斛莖，用剪刀剪成塊莖，每塊大概0.3cm即可，分別用潔凈的紗布包好，放入燒杯中，向每個燒杯中加160mL蒸餾水，65℃水浴進行提取9h，分3次浸提，每次3h，提取結束后分別收集水提糖蛋白粗樣液，向3份粗樣液中分別加入50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇進行醇沉，醇沉4℃冰箱過夜→離心（4000r/min，40min）分別收集加入不同濃度乙醇所得到的沉淀，分別收集3份離心上清液再次加入相應濃度的乙醇進行醇沉，離心（4000r/min，40min）收集沉淀，將2次所得的沉淀倒在一起→去離子水復溶，分別收集3種濃縮液，即所得為水提醇沉糖蛋白提取濃縮液。

1.3.3 12%SDS-PAGE電泳[10] （1）搭膠板：制膠架玻璃板，將4塊玻璃板洗凈晾干，裝到mini電泳架上，加底板，檢漏，共2塊膠板。（2）制膠：按照表1配制2倍的分離膠，TEMED加入后迅速將分離膠加入膠板，分離膠加至制膠架水平位置。緩慢加入蒸餾水少許水封30min。確定凝固后配制2倍的濃縮膠，將水全部倒掉加濃縮膠至玻板口，然后加梳子。待濃縮膠凝固拔出梳子，拆去底板，將mini電泳架放到電泳槽內，加500mL稀釋后的SDS電泳緩沖液。

（3）加樣：取6個eppendorf離心管，分別向6個離心管內加入50μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液，再分別加入100μL的一級沉淀樣液、二級沉淀樣液、三級沉淀樣液以及50%乙醇醇沉樣液、70%乙醇醇沉樣液、90%乙醇醇沉樣液。煮沸5～10min，12000r/min離心1min，用移液槍加樣，蛋白Marker第1個加樣槽內加10μL，提取濃縮液每個加樣槽內加20～40μL，共2塊膠板（蛋白Marker是小量分裝，避免了反復凍融，如長期貯存后使用，使用前最好取分裝后的小管沸水浴預熱3～5min后再上樣電泳）。

（4）電泳：接好正負極，打開電源，開始電壓設為75V，待樣品進入分離膠后改為120V，電泳時間2.5h左右。待溴酚藍條帶遷移至下端1～1.5cm時停止電泳。

（5）剝膠、染色與脫色：取下2塊膠板，去除玻璃板，每塊膠都從中間切開，50%考馬斯亮藍染色，50%PAS染色，染色15min，染色結束后將染色液回收，用水稍微沖洗，加脫色液脫色，1h換一次脫色液，至背景清晰。

（6）PAS染色：將電泳結束后的膠用Schiff試劑染色15min后，用脫色液脫色1h，最后用0.5%偏重亞硫酸鈉溶液漂洗，至出現粉紅色條帶。

2 結果與分析

2.1 鹽提糖蛋白電泳結果 鹽溶液浸提物電泳結果見圖1，浸提物電泳后分別平行進行了考馬斯亮藍染色和PAS染色。

2.2 水提醇沉提糖蛋白電泳結果 水提醇沉糖蛋白電泳結果見圖2，水提醇沉產物電泳后分別平行進行了考馬斯亮藍染色和PAS染色。

2.3 電泳結果分析 由表2可知，一級樣液中的蛋白分子分布在31～97.4kDa，共有8條帶，多糖分子分布在31～66.2kDa，共有5條帶。二級樣液中的蛋白分子分布31～66.2kDa和14.4kDa處，共5條帶，多糖分子在31～66.2kDa和14.4kDa處，共6條帶。三級樣液中的蛋白分子分布在31～66.2kDa共3條帶，多糖分子31～66.2kDa，共3條帶。

由表3水提醇沉浸提糖蛋電泳條帶結果可以看出，50%乙醇醇沉樣液，70%醇沉樣液，90%醇沉樣液中的蛋白分子都分布在43～66.2kDa，各有2條帶，多糖分子也分布在43～66.2kDa，同樣各有2條帶，與鹽提產物染色條帶的結果對應。

3 結論

經12%SDS-PAGE電泳圖來看，鹽提糖蛋白方法無論是提取蛋白還是提取多糖，其提取效果均優于水提糖蛋白方法。從提取的蛋白及多糖的種類分析，鹽提糖蛋白法也優于水提糖蛋白法。

參考文獻

[1]包雪聲，順慶生，陳立鉆.中國藥用石斛[M].上海：復旦大學出版社，2001：75.

[2]呂圭源，陳素紅，張麗丹，等.鐵皮石斛對小鼠慢性酒精性肝損傷模型血清2種轉氨酶及膽固醇的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（6）：192-193.

[3]張紅玉，戴關海，馬翠，等.鐵皮石斛多糖對S-（180）肉瘤小鼠免疫功能的影響[J].浙江中醫雜志，2009，44（5）：380-381.

[4]鮑素華，查學強，郝杰，等.不同分子量鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性研究[J].食品科學，2009，70（21）：123-127.

[5]王令儀.石斛多糖和生物堿測定及多糖抗衰老實驗研究[D].遵義：遵義醫學院，2009.

[6]呂素芳，郭廣君，蔡永萍.霍山石斛生理生化性質的研究進展[J].中草藥，2006，05：790-793.

[7]泰宏偉，楊紅花，史春余.甘薯糖蛋白的分離純化工藝研究[J].食品工業科技，2006（9）：142-145.

[8]丁青芝，馬海樂，駱琳，等.山藥糖蛋白的分離純化與鑒定[J].食品科學，2008，29（7）：217-220.

[9]HASCALL V C，CALABRO A，MIDURA R J，et al. Isolation and characterization of proteoglycans[J].Methods Enzymol.1994（230）：390-417.

[10]郭堯君.蛋白質電泳實驗技術[M].2版.北京：科學出版社，2005（9）：2. （責編：張宏民）