褪黑素用于胚胎培養(yǎng)對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能低下患者體外受精-胚胎移植治療效果的影響

王凱娟，朱 琦，丁 丁，張 弨，曹云霞，陳蓓麗，章志國

卵巢儲(chǔ)備功能低下(decreasing ovarian reserve, DOR)是指女性卵巢內(nèi)儲(chǔ)備的卵泡數(shù)目減少，排出的卵子質(zhì)量下降，導(dǎo)致患者生育功能減退，常伴有基礎(chǔ)卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)水平降低以及竇卵泡數(shù)目(antral follicle count，AFC)減少[1]。DOR患者臨床上常表現(xiàn)為月經(jīng)周期不規(guī)律、經(jīng)量減少、閉經(jīng)和不孕等。該類患者在輔助生殖技術(shù)助孕過程中常面臨獲卵數(shù)少，周期取消率高的困境，讓臨床醫(yī)師和胚胎學(xué)家非常棘手。研究[2-3]報(bào)道DOR可能與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，而褪黑素(melatonin，MT)有強(qiáng)大的抗氧化性，研究[4]顯示將MT添加至小鼠的體外培養(yǎng)液中能明顯提高其囊胚形成率。該研究探討了在胚胎培養(yǎng)液中添加MT是否可以改善DOR患者輔助生殖治療過程中的胚胎發(fā)育情況及最終的臨床結(jié)局。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2020年8—11月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行體外受精-胚胎移植(invitrofertilization and embryo transfer, IVF-ET)的DOR患者128例，通過擲硬幣方式將其隨機(jī)分為褪黑素組(n=56)和對(duì)照組(n=72)。進(jìn)一步對(duì)采取IVF和ICSI方案的褪黑素組和對(duì)照組患者進(jìn)行分組，分為采取IVF方案的褪黑素A1組患者(n=37)和對(duì)照B1組患者(n=52)，采取ICSI方案的褪黑素A2組患者(n=19)和對(duì)照B2組患者(n=20)。根據(jù)本課題組之前的研究[5-6]結(jié)果，添加10-9mol/L的MT(美國Sigma公司)可以改善未成熟卵子的后期發(fā)育質(zhì)量，該研究在褪黑素組的胚胎培養(yǎng)液中添加該濃度的MT。兩組患者的一般臨床資料如年齡、基礎(chǔ)FSH值、體重指數(shù)(body mass index, BMI)及患者的不孕類型等基本資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。收集標(biāo)準(zhǔn)：基礎(chǔ)FSH水平>10 IU/L；AMH值<1.11 μg/L；卵泡早期經(jīng)陰道B超提示雙側(cè)竇卵數(shù)≤7個(gè)，滿足上述其中兩條即可[1]。排除患者雙方染色體檢查異常、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥及排除男方嚴(yán)重少弱精子癥引起的不孕癥等。

表1 DOR患者的基本臨床資料

1.2 控制性促排卵方案月經(jīng)來潮第2～4天根據(jù)性激素水平和卵巢情況啟動(dòng)促性腺激素釋放激素拮抗劑(gonadotropin releasing hormone antagonist, GnRH-ant)方案(麗申寶、HMG或果納芬)，藥物使用5 d后開始監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況。當(dāng)≥3個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18 mm，平均每成熟卵泡E2水平為200～300 ng/L，注射hCG(5 000～10 000)IU或rhCG 250 μg，36 h后B超引導(dǎo)下行陰道穿刺取卵術(shù)。

1.3 胚胎培養(yǎng)取卵后根據(jù)精子質(zhì)量行常規(guī)體外受精(invitrofertilization, IVF)或卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)受精，IVF受精后5 h拆除卵周顆粒細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞是否排出第二極體以確認(rèn)受精，若受精將其移至卵裂期培養(yǎng)液(澳大利亞COOK公司)中(褪黑素組于卵裂期培養(yǎng)液添加MT)；ICSI受精后立即移至卵裂期培養(yǎng)液中(褪黑素組于卵裂期培養(yǎng)液添加MT)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。所有卵裂期胚胎均在受精后第3天移至囊胚期培養(yǎng)液(澳大利亞COOK公司)中(褪黑素組置于囊胚期培養(yǎng)液添加MT)，受精第5～6天觀察囊胚形成情況，囊胚期胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Garnder囊胚分級(jí)法。

1.4 胚胎冷凍及解凍胚胎評(píng)分第5天(D5)囊胚等級(jí)大于等于3BC和第6天囊胚等級(jí)(D6)大于等于4BC者可冷凍。取卵術(shù)后第2次或第3次月經(jīng)來潮后可準(zhǔn)備移植冷凍胚胎。

1.5 胚胎移植該研究納入的所有患者均選擇凍融周期進(jìn)行胚胎移植，當(dāng)患者子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm且形態(tài)較好時(shí)，肌注黃體酮或人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)，數(shù)天后行胚胎移植。移植后繼續(xù)予以黃體支持，移植第14天檢測(cè)血或尿hCG值，若為陽性則繼續(xù)支持治療。并于移植后第28～30天行陰道超聲檢查宮腔內(nèi)有無孕囊以明確臨床妊娠的診斷。

1.6 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)比較兩組間卵子成熟率、受精率、卵裂率、第3天(D3)優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率、囊胚種植率及臨床妊娠率是否存在差異。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素組與對(duì)照組的胚胎發(fā)育情況及臨床結(jié)局比較兩組的卵子成熟率、受精率和卵裂率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但褪黑素組的D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚率均較對(duì)照組增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；褪黑素組獲得優(yōu)質(zhì)囊胚的周期占比數(shù)較對(duì)照組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。已移植周期中褪黑素組(n=31)和對(duì)照組(n=50)的著床率和臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(目前未出現(xiàn)流產(chǎn)情況)。見表3。

表2 DOR患者卵子的成熟、受精及胚胎早期發(fā)育狀況[%(n/N)]

表3 DOR患者移植后的妊娠結(jié)局[%(n/N)]

2.2 采取IVF方案的褪黑素組和對(duì)照組患者的卵子受精及胚胎早期發(fā)育結(jié)果A1組和B1組的受精率、卵裂率、囊胚形成率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A1組D3優(yōu)質(zhì)胚胎率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均較B1組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 褪黑素組和對(duì)照組IVF患者受精及胚胎早期發(fā)育狀況比較[%(n/N)]

2.3 采取ICSI方案的褪黑素組和對(duì)照組患者的卵子受精及胚胎早期發(fā)育結(jié)果A2組和B2組的受精率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A2組卵裂率較B2組低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

表5 褪黑素組和對(duì)照組ICSI患者受精及胚胎早期發(fā)育狀況比較[%(n/N)]

3 討論

卵巢儲(chǔ)備功能減退是一個(gè)漸進(jìn)的過程，早期DOR若未及時(shí)診治，可能進(jìn)一步發(fā)展到早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)，甚至卵巢早衰[7]。在該研究中，通過在DOR患者的胚胎培養(yǎng)液中添加MT，觀察其胚胎發(fā)育情況及臨床治療結(jié)局以了解MT是否能改善胚胎發(fā)育。

IVF方案兩組患者的受精率、卵裂率、囊胚形成率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但A1組D3優(yōu)質(zhì)胚胎率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均高于B1組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，ICSI方案兩組患者的受精率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但卵裂率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，在精子質(zhì)量有保障的前提下，MT可以提高卵子發(fā)育潛力，改善胚胎發(fā)育質(zhì)量。

胚胎質(zhì)量是影響胚胎著床的決定性因素之一，獲得更多優(yōu)質(zhì)囊胚的DOR患者受孕概率增加[12-13]。Asgari et al[14]在小鼠胚胎培養(yǎng)液中分別添加10和100 nmol/L的MT，卵裂率、囊胚的總細(xì)胞數(shù)及胚胎植入均有顯著改善。Tamura et al[15]在2020年發(fā)表的系統(tǒng)性綜述中分析了13份動(dòng)物培養(yǎng)液中添加MT的實(shí)驗(yàn)報(bào)導(dǎo)，5份關(guān)于人類不孕癥和1份關(guān)于DOR患者口服MT的病例報(bào)導(dǎo)，結(jié)果顯示MT能改善動(dòng)物卵母細(xì)胞的質(zhì)量和胚胎發(fā)育，并促進(jìn)不孕癥患者卵子成熟及提高胚胎質(zhì)量。但褪黑素組所獲得優(yōu)質(zhì)囊胚的周期數(shù)較對(duì)照組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。目前對(duì)于人類胚胎培養(yǎng)液中直接添加MT的研究尚少，該研究的結(jié)果證明了在胚胎培養(yǎng)液中添加MT能夠促進(jìn)DOR患者的胚胎發(fā)育，獲得更多的優(yōu)質(zhì)胚胎，從而為DOR患者的生育力改善提供更多的保證。該研究中，褪黑素組和對(duì)照組的著床率和臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩組優(yōu)質(zhì)囊胚質(zhì)量是相當(dāng)?shù)摹Ｒ虼耍纳艱OR患者臨床結(jié)局的關(guān)鍵就是盡可能獲得更多優(yōu)質(zhì)囊胚。該研究結(jié)果顯示褪黑素組所獲優(yōu)質(zhì)囊胚的周期占比數(shù)較對(duì)照組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明MT應(yīng)用于早期胚胎的體外培養(yǎng)能提高DOR患者卵子的發(fā)育潛力，使更多治療周期獲得優(yōu)質(zhì)囊胚，進(jìn)而改善DOR患者的治療效果。

綜上所述，MT應(yīng)用于早期胚胎的體外培養(yǎng)在一定程度上能促進(jìn)DOR患者卵子的發(fā)育，提高胚胎質(zhì)量，改善DOR患者的治療效果，為DOR患者的臨床治療提供了一種新思路，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。