表層蛋白對嗜酸乳桿菌NCFM生長代謝的影響

李佳珣，張秋香，王瑞，趙建新

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

許多乳桿菌的表面都包裹著一層蛋白質，即表層蛋白。攜帶此類蛋白的乳桿菌有嗜酸乳桿菌、發酵乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、格氏乳桿菌、短乳桿菌、約氏乳桿菌等[1]。嗜酸乳桿菌是一類重要的益生菌，能緩解輪狀病毒腹瀉、腹瀉型腸易激綜合征及牛乳過敏等，主要通過定殖于宿主腸道、與致病菌競爭黏附位點、調節機體免疫等機制實現其益生功能[2-3]。

表層蛋白不僅作為黏附因子幫助乳桿菌定殖于腸道，其對菌株的本身特性有很多影響，ABRAMOV等[4]構建了4個嗜酸乳桿菌表層蛋白突變體，在存在酒精、膽鹽等環境脅迫的條件下4個突變體的生長速度有顯著差異，這表明表層蛋白的存在影響了嗜酸乳桿菌在不良環境中的生長。同時，表層蛋白的剝離使嗜酸乳桿菌的黏附性降低，且剝離后的乳桿菌菌量降低1～2個對數級[5]，表明其生長狀態受到表層蛋白剝離的影響，而菌體的生長狀態與代謝水平息息相關。

近年來，為更加深入地了解表層蛋白的特性以推動其在生物技術領域的應用，許多研究從基因水平[6]、蛋白質水平[7]等方面闡述了乳桿菌表層蛋白特性，而在代謝水平上，表層蛋白對嗜酸乳桿菌的影響尚不清楚。非靶向代謝組學廣泛應用于分析生物個體的代謝狀態，它可以對生物系統的各種生化代謝物進行輪廓分析，其主要基于核磁共振波譜儀(nuclear magnetic resonance spectrometer，NMR)、GC-MS、液相色譜-質譜聯用儀(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)等平臺[8]。目前，對于嗜酸乳桿菌NCFM表層蛋白的研究較為廣泛且深入，在了解其氨基酸組成的基礎上，本研究擬通過基于GC-MS的非靶向代謝組學揭示嗜酸乳桿菌NCFM表層蛋白對嗜酸乳桿菌的自聚集能力、菌體生長、代謝產物等特性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

嗜酸乳桿菌NCFM，美國菌種保藏中心，由江南大學食品生物技術中心保藏。

1.2 試劑與儀器

甲醇(HPLC級)、乙腈(HPLC級)，Merck KGaA，吡啶溶液(99%)、N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷[N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide+1% trimethylchlorosilane, MSTFA+1%TMCS]、甲氧胺鹽酸鹽(methoxyamine hydrochloride，MeOX)，Sigma，LiCl(分析純)，國藥滬試。

Trace 1310-TSQ8000氣質聯用儀、真空干燥機，Thermo公司；高通量組織破碎儀，新芝；酶標儀，ThermoFisher；干式恒溫金屬浴，杭州瑞誠儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳桿菌的培養

取出-80 ℃保藏的菌種，以2%的接種量接種于 5 mL MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養 18 h。活化3代后可用于實驗。

1.3.2 表層蛋白的去除

參考JOHNSON等[9]的方法并做適當改動。培養好的菌液于室溫下6 000×g離心15 min，收集菌體。向菌體中加入原乳桿菌培養液1/20體積的5 mol/L LiCl溶液并置于恒溫搖床(37 ℃，220 r/min)處理2 h后，于室溫下12 000 ×g離心15 min。棄上清液,得到的菌體即為去除表層蛋白的乳桿菌，空白對照組以生理鹽水代替。

1.3.3 乳桿菌的生長及自聚集能力測定

將去除表層蛋白和對照組的乳桿菌以2%的接種量接種于 5 mL MRS 培養基中，37 ℃靜置培養18 h。調節菌懸液的濃度為108CFU/mL,記錄其OD值為A0，將菌懸液渦旋振蕩約10 s，室溫靜置4 h，上清液的OD600nm記為A4，按如下公式計算自聚集率[10]。

1.3.4 胞內代謝物的提取

將1.3.2收集的菌體置于1.5 mL EP管中，迅速放入液氮中淬滅，置于-80 ℃冰箱備用。加入400 μL預冷的提取劑[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1]，再加入100 μL的小磁珠，放在預冷的模塊中，以高通量組織破碎儀破碎。高通量組織破碎儀參數設置為破碎45 s，停15 s，循環10次。破碎后于4 ℃以12 000×g離心15 min，收集提取液，并轉移至新的離心管中。每個樣品取300 μL上清液放入真空濃縮儀，于45 ℃，0.1 kPa干燥1.5 h，得到干燥不含水的代謝組樣品[11]。為確保試驗的準確性，每組設置6個平行。

1.3.5 代謝物的衍生化

加入100 μL的0.1 mg/mL甲氧胺鹽酸吡啶溶液，渦旋振蕩30 s，于37 ℃干式恒溫金屬浴90 min，然后加入40 μL的MSTFA試劑(含1% TMCS)，37 ℃金屬浴30 min[12]。室溫12 000×g離心15 min，吸取100 μL上清液至內襯管中，進行GC-MS分析。

1.3.6 GC-MS條件

掃描的質量數為33～600m/z，離子源類型為EI源，程序升溫：起始溫度為70 ℃，以5 ℃/min 的升溫速率提高至 230 ℃，后以90 ℃/min的升溫速率提高至 320 ℃，在此條件下維持5 min；載氣(He)流速1 mL/min；電子電離能量：70 eV；柱子型號為 RTX-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)[11]。

1.3.7 數據采集與分析

使用氣質聯用儀對胞內代謝物進行檢測分析，使用AbfConverter.4.0.0軟件進行格式轉換，用MS-DIAL 4.3.8 軟件對所產生的原始數據文件進行峰提取、保留時間校正、峰對齊等處理得到包括胞內代謝物的質譜信息、峰面積和保留時間等相關數據，用MS-DIAL4.3.8軟件配置的DB_FiehnBinbase-FiehnRI數據庫[13]進行化合物的鑒定。將得到的歸一化后的峰面積數據矩陣導入metaboanalyst 4.0[14]進行數據分析及代謝通路分析，使用R包PCAtools,DESeq2,ggplot2等進行可視化。結合T檢驗尋找差異代謝物和計算顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌自聚集及生長特性

5 mol/L的氯化鋰溶液可以去除菌體表面超過90%的表層蛋白，且不會導致菌體失活[15]，故本研究采取該方法以去除表層蛋白。乳桿菌的生長和自聚集率變化如表1所示。嗜酸乳桿菌NCFM自聚集率變化則隨表層蛋白的去除有顯著下降，表明表層蛋白在嗜酸乳桿菌NCFM的黏附性上起重要作用，這也與文獻報道相符合[16]。LiCl處理后嗜酸乳桿菌生長終濃度比對照組低，我們推測表層蛋白的去除會造成乳酸菌胞內氨基酸含量的降低，而氨基酸的重新合成，需要糖酵解和三羧酸循環途徑過程中產生的能量，故影響菌體的正常生長和代謝，導致生長速率降低[17]。

表1 嗜酸乳桿菌對照組、氯化鋰處理組自聚集率變化及生長情況變化Table 1 The self-aggregation rate and growth of Lactobacillus acidophilus in control, treated with lithium chloride

2.2 乳桿菌胞內代謝物分析

采用基于GC-MS的代謝組學分析技術，測定表層蛋白去除與否對乳酸菌胞內代謝物的影響，并用主成分分析(principal component analysis，PCA)對胞內代謝物進行輪廓分析，結果如圖1-A所示。本次試驗中，使用 PCA 模型可以取得較好的擬合效果，模型的PC1和PC2分別為53%和26.9%，滿足數據的擬合要求。從圖1-A可看出，表層蛋白的去除對乳酸菌胞內代謝有顯著影響，處理組與對照組的樣本在得分圖上可以較好的分開，并且組內的6個樣本點具有較好的統一性。

與PCA相似，偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)也是目前代謝組學數據分析中最常使用的一種分類方法，為有監督的分析方法，它在降維的同時結合了回歸模型[18]，可以結合判別閾值VIP(variable important in projection)值化合物進行差異分析，便于尋找差異代謝物。PLS-DA的結果如圖1-B所示。2組的樣品各居一側，區分效果明顯，說明表層蛋白的去除對乳桿菌細胞內代謝產生影響，胞內的小分子代謝物存在差異。

A-PCA得分圖；B-PLS-DA結果圖圖1 GC-MS分析嗜酸乳桿菌NCFM對照組和氯化鋰處理組2組樣品的PCA得分圖和PLS-DA結果圖Fig.1 The analysis results in GC-MS of the PCA and PLS-DA between two groups of samples of Lactobacillus acidophilus control and treated with lithium chloride

PLS-DA分析顯示有組分類和成對判別，模型中的VIP值大于1的化合物表示對2組的分離具有顯著貢獻[18]，在該PLS-DA模型中鑒別出13個投影值(VIP值)大于1的差異代謝物，如圖2-A所示。結合VIP值、Fold Change和P值進行差異代謝物的篩選，為直觀地表現出代謝物的差異情況，以及顯示2組樣品之間的總體模式特征，對差異代謝物繪制了火山圖(圖2-B)和聚類熱圖(圖2-C)。由圖2-A可知，乳酸的VIP值很高，表明乳酸含量在兩組間差異顯著(圖2-A)。同時，多種有機酸、部分糖類物質的含量隨表層蛋白的缺乏而表現出顯著的變化。乳桿菌降解葡萄糖，發生糖酵解過程產生丙酮酸，乳酸脫氫酶會將丙酮酸還原為乳酸，乳酸作為乳桿菌糖代謝過程中的重要終產物[19]，在去除表層蛋白后乳酸積累增加。這與蘋果酸、烯醇式丙酮酸等物質表現出明顯的上調趨勢相一致，說明表層蛋白的缺乏可能使乳酸菌需要更加旺盛的糖代謝，以滿足氨基酸合成及菌體自身生長代謝所需要的能量，此時氨基酸合成會競爭生長所需要的能量[17]。從火山圖(圖2-B)可以看出，GC-MS鑒定到129種已知的化合物，其中15種代謝物|log2FoldChange|>1，為顯著差異代謝物。在聚類熱圖(圖2-C)中，多種氨基酸、有機酸、糖有顯著差異，這可能與氨基酸合成和能量代謝密切相關。

A-VIP得分圖；B-差異代謝物火山圖；C-差異代謝物熱圖圖2 嗜酸乳桿菌NCFM對照組和氯化鋰處理組2組樣品差異代謝物，VIP得分圖，差異代謝物火山圖，差異代謝物熱圖Fig.2 Different metabolites between two groups of Lactobacillus acidophilus control and lithium chloride treatment, VIP score plot, volcano of different metabolites, heatmap of different metabolites

乳桿菌的表層蛋白等電點偏堿性，其原因是帶正電荷的氨基酸遠高于帶負電荷的氨基酸。同時表層蛋白中帶羥基的氨基酸含量也比較高，占比為 23.0%～33.0%[20]。從聚類熱圖(圖2-C)可以看出，其中的鳥氨酸、組氨酸、酪氨酸呈下調趨勢，以其峰面積表示相對含量，對其進一步進行T檢驗，如圖3-B～圖3-D所示，分析2組樣品這3種氨基酸含量具有顯著差異。鳥氨酸為一種堿性氨基酸，為精氨酸分解而成的產物，而組氨酸為帶正電的氨基酸，嗜酸乳桿菌fb116， 嗜酸乳桿菌fb214的表層蛋白分別含有3.99、4.82 mg/g的組氨酸[21]。酪氨酸是一種含有酚羥基的芳香族極性α-氨基酸，嗜酸乳桿菌fb116，嗜酸乳桿菌fb214分別含有4.26、6.12 mg/g的酪氨酸[21]。它們為組成乳桿菌表層蛋白的氨基酸，在5 mol/L的氯化鋰溶液處理后含量降低，而重新合成氨基酸需要時間積累，故含量顯著低于對照組。

c-對照組；t-氯化鋰處理組A-乳酸；B-組氨酸；C-鳥氨酸；D-酪氨酸圖3 嗜酸乳桿菌NCFM對照組、氯化鋰處理組2組樣品部分差異代謝物Fig.3 Different metabolites between two groups of Lactobacillus acidophilus control and lithium chloride treatment

2.3 代謝通路分析

對VIP>1或|log2FoldChange|>1的差異代謝物進行代謝通路富集分析，如圖4所示，結果表明精氨酸和脯氨酸代謝、賴氨酸的生物合成、精氨酸生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝這5條代謝通路得到了顯著富集，其P<0.1，這表明去除表層蛋白后的一段時間內，氨基酸相關代謝十分活躍，這也暗示菌體的表層蛋白又在重新合成。這與先前文獻報道的表層蛋白去除后過一段時間又可以在菌體上檢測到表層蛋白的現象一致[22]。乳桿菌的表層蛋白總氨基酸含量約為36%，其中，酸性氨基酸含量約為15%，稍低于堿性氨基酸含量[20]。賴氨酸最為常見合成表層蛋白的堿性氨基酸，約占10%。組氨酸、精氨酸含量則相對較低。精氨酸和脯氨酸代謝、賴氨酸的生物合成、精氨酸生物合成與表層蛋白組成的氨基酸合成密切相關，同時，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝通路也被富集到了，這與文獻報道表層蛋白中的酸性氨基酸包括丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸[23]相符合。

圖4 兩組樣品差異代謝物代謝通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis of metabolic pathways of different metabolites between two groups

3 結論

本研究采用代謝組學分析技術研究表層蛋白對乳酸菌胞內代謝的影響，結果表明表層蛋白缺乏對乳酸菌胞內代謝輪廓有顯著影響。表層蛋白的去除對乳酸菌氨基酸代謝有顯著影響，胞內氨基酸濃度的低水平使得菌株需要更多的能量以恢復表層蛋白，并有可能通過競爭能量和中間產物使三羧酸循環的效率下降，對乳酸菌的生長代謝產生影響，本研究結果為表層蛋白在菌體生長代謝過程中的作用提供理論指導。對于非靶向代謝組學鑒定到的化合物，具體功能和含量后續仍需通過化合物鑒定和HPLC等設備進行更加精確的定量。