蘇木乙酸乙酯提取液通過miR-150/ELK1信號對血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響*

王 倩 袁星星 周亞濱 楊建飛 李鑫峰

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；4.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

動脈粥樣硬化（AS）作為一種大中型動脈血管壁的慢性炎癥性疾病，是誘導(dǎo)缺血性心臟病的主要病理基礎(chǔ)，已成為我國人口死亡的重要原因之一［1］。由于AS具有復(fù)雜的病理機制，積極探索新的突破點對于提高其整體的防治水平具有重要意義。過去認為血栓機化與再形成和內(nèi)膜細胞增生理論是AS發(fā)生的主要病理機制，然而越來越多的研究認為內(nèi)皮細胞損傷是AS早期形成的始動因素，并且發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞凋亡與AS發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)聯(lián)［2-3］。

作為AS的重要危險因素之一，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷凋亡，從而失去調(diào)節(jié)免疫、炎癥和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的能力［4-5］。此外，內(nèi)皮細胞凋亡還可以促進內(nèi)皮細胞剝脫和泡沫細胞形成，是穩(wěn)定斑塊表型向血栓形成和侵蝕斑塊轉(zhuǎn)變的一個關(guān)鍵步驟［6-8］。課題組前期通過體內(nèi)和體外研究顯示，蘇木乙酸乙酯提取液（SAEE）具有調(diào)控血脂、抗炎、免疫抑制和穩(wěn)定斑塊的作用［9-13］。因此，在本研究中課題組擬通過觀察SAEE對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡及miR-150/ELK1信號通路的影響，以期進一步明確SAEE的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（HUVEC）購于武漢佰仟度生物科技有限公司，該細胞株由美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）引進。

1.2 藥物及試劑

蘇木購于貴州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，使用前經(jīng)粉碎、乙醇提取、乙酸乙酯萃取后得到SAEE（純度98%）；ox-LDL購于北京索萊寶科技有限公司（貨號：H7980）；RPMI 1640、10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉素混合液購于美國Gibco公司（貨號分別為：A4192301、16140071和10378016）。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和ELK1兔單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）購于上海碧云天生物科技公司（貨號分別為：C1062M、AF1585和A0208）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司（貨號：RR047A）；RNA提取試劑盒和SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒購于美國Thermo Fisher公司（貨號分別為：15596026、A25742）；miRNA-150 mimics由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成（批號：191019）。

1.3 分組與干預(yù)

HUVEC用RPMI1640培養(yǎng)基（含10%FBS和100 μg/mL青霉素/鏈霉素混合液）于5%二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的細胞以2×105/孔接種于6孔板中，分為空白組、模型組、SAEE組、模擬劑組和SAEE+模擬劑組，其中除空白組外，其余組參照文獻［14］中方法采用100 μg/mL ox-LDL對細胞進行誘導(dǎo)構(gòu)建內(nèi)皮細胞損傷模型。同時，SAEE組和SAEE+模擬劑組加入200 μg/mL SAEE進行干預(yù)，模擬劑組和SAEE+模擬劑組按照說明書采用Lipofectamine 2000將100 nmoL miRNA-150 mimics轉(zhuǎn)染至細胞。

1.4 指標檢測

1.4.1 流式細胞術(shù) 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡水平。于48 h收集各組細胞，胰酶消化，預(yù)冷PBS離心5 min后以binding buffer重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC于4℃冰箱避光孵育30 min，再加入5 μL碘化丙啶繼續(xù)孵育5m in，流式細胞儀檢測并分析細胞凋亡率。

1.4.2 Western blotting檢測 于48 h收集各組細胞，PBS洗滌細胞后加入RIPA裂解液于冰上裂解30 min，離心收集上清后以BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白通過SDS-PAGE進行分離后轉(zhuǎn)膜至PVDF。5%脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋后的一抗：ELK1（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗室溫下繼續(xù)孵育1 h。超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影后凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用Image J軟件對目的條帶進行分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.4.3 MDA含量、LDH釋放量、SOD和Caspase-3活性檢測 于48 h收集各組細胞培養(yǎng)液，分別采用硫代巴比妥酸法、比色法和黃嘌呤氧化酶法測定MDA含量、LDH釋放量、Caspase-3和SOD活性。實驗步驟嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.4.4 RT-PCR法檢測 于48 h收集各組細胞，分別采用相應(yīng)的試劑盒提取細胞中總RNA或miRNA，按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物：ELK1，正義鏈 5'-GTAGAAGGGCC CAAGGAAGAGTTG-3'；反義鏈5'-CTGGGCGCTGCCACTGGATGGAAACTGGAA-3'。Bax：正義鏈 5'-AGGAGCAGGTGCCTACAAGA-3'；反義鏈 5'-GCATTTTC CCACCACTGTCT-3'。Bcl-2：正義鏈 5'-AGGAGCAGGTGCCTACAAGA-3'；反義鏈5'-GCATTTTCCCACCACTGTCT-3'。Caspase-3：正義鏈5'-CTGGACTGC GGTATTTGAGAC-3'；反義鏈5'-CCGGGTGCGGTAGAGTAAGC-3'。GAPDH：正義鏈5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'；反義鏈5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。miR-150：正義鏈5'-TCTCCCAACCCTTGTACC-3'；反義鏈5'-CGAGGAAGAAGACGGAAGAAT-3'。U6：正義鏈 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反義鏈 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。使用上述產(chǎn)物與SYBR Green PCR預(yù)混液于ABI 7900PCR機器上進行實時PCR。PCR循環(huán)條件為：95°C循環(huán)1 min，95℃循環(huán)40次，15 s，60℃循環(huán)15 s，72 ℃循環(huán)45 s。采用2-ΔΔCt法計算相對基因和miR-150的表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。所有實驗均重復(fù)至少3次并且數(shù)據(jù)均以（）表示，定量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HUVEC細胞形態(tài)的比較

見圖1。倒置相差顯微鏡顯示，正常HUVEC形態(tài)良好，呈橢圓形、梭形，細胞核明顯，呈鋪石路樣排列。模型組細胞較空白組變小，并且出現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)。SAEE組細胞形態(tài)及排列較模型組明顯改善，但模擬劑組細胞損傷較模型組加重，而SAEE+模擬劑組細胞形態(tài)及排列與模型組比較無明顯改善。

圖1 各組HUVEC細胞形態(tài)的比較（200倍）

2.2 各組細胞中miR-150表達的比較

見表1。與空白組相比，模型組miR-150的表達水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，SAEE組miR-150的表達水平顯著降低，模擬劑組miR-150的表達水平顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而SAEE+模擬劑組miR-150的表達水平與模型組比較略減降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組細胞中miR-150表達的比較（±s）

表1 各組細胞中miR-150表達的比較（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，□P＜0.05。下同。

組別空白組模型組SAEE組模擬劑組SAEE+模擬劑組miR-150/U6 1.00±0.03 2.42±0.42△1.53±0.27□3.67±0.71□2.26±0.35

2.3 各組HUVEC細胞凋亡的比較

見表2，圖2。與空白組相比，模型組早期凋亡和總凋亡率均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，SAEE組早期凋亡和總凋亡率均顯著降低，模擬劑組早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而SAEE+模擬劑組凋亡率與模型組比較略減降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組細胞凋亡的比較（%，±s）

表2 各組細胞凋亡的比較（%，±s）

組 別 早期凋亡率 晚期凋亡率 總凋亡率5.81±0.56 12.42±1.12△7.53±1.27□14.53±2.27□11.46±0.95空白組模型組SAEE組模擬劑組SAEE+模擬劑組4.18±1.04 3.89±2.11 4.81±0.84 8.21±1.24□3.71±0.67 9.95±0.94 16.38±1.92△12.15±1.16□22.36±3.17□15.98±1.83

圖2 各組HUVEC細胞凋亡的比較

2.4 各組細胞中ELK1表達的比較

見表3，圖3。與空白組相比，模型組ELK1蛋白及mRNA的表達水平顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，SAEE組ELK1蛋白及mRNA的表達水平顯著增加，模擬劑組ELK1蛋白及mRNA的表達水平顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而SAEE+模擬劑組miR-150的表達水平與模型組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組細胞中ELK1蛋白及mRNA表達的比較（±s）

表3 各組細胞中ELK1蛋白及mRNA表達的比較（±s）

組別空白組模型組SAEE組模擬劑組SAEE+模擬劑組ELK1/β-actin 1.10±0.13 0.42±0.06△1.03±0.17□0.21±0.05□0.46±0.11 ELK1/GAPDH 1.00±0.04 0.51±0.08△1.32±0.19□0.25±0.07□0.54±0.09

圖3 各組細胞中ELK1蛋白表達的比較

2.5 各組細胞中MDA、LDH和SOD水平的比較

見表4。與空白組相比，模型組MDA含量和LDH釋放量顯著增加，SOD活性顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，SAEE組MDA含量和LDH釋放量顯著降低，SOD活性顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模擬劑組MDA含量和LDH釋放量顯著增加，SOD活性顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而SAEE+模擬劑組MDA含量、LDH釋放量和SOD活性與模型組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組細胞中MDA、LDH和SOD水平的比較（±s）

表4 各組細胞中MDA、LDH和SOD水平的比較（±s）

組別空白組模型組SAEE組模擬劑組SAEE+模擬劑組MDA（μmol/L）7.12±0.63 28.19±1.42△10.25±1.27□37.22±2.71□26.17±1.21 LDH（U/L）587.34±78.36 1 388.39±182.54△729.64±91.08□1 682.35±214.79□1 297.84±174.95 SOD（U/mL）52.19±4.72 34.71±3.18△46.96±3.67□28.96±2.79□35.59±3.32

2.6 各組細胞中Caspase-3活性的比較

見表5。與空白組相比，模型組Caspase-3活性顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，SAEE組Caspase-3活性顯著降低，模擬劑組Caspase-3活性顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而SAEE+模擬劑組Caspase-3活性較模型組略降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組細胞中Caspase-3活性的比較（U/mg，±s）

表5 各組細胞中Caspase-3活性的比較（U/mg，±s）

組別空白組模型組SAEE組模擬劑組SAEE+模擬劑組Caspase-3 5.37±0.59 33.82±3.27△10.13±1.03□41.52±4.87□31.06±4.11

2.7 各組細胞中凋亡基因表達的比較

見表6。與空白組相比，模型組Bax和Caspase-3 mRNA的表達水平顯著增加，Bcl-2 mRNA的表達水平顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，SAEE組Bax和Caspase-3 mRNA的表達水平顯著降低，Bcl-2 mRNA的表達水平顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模擬劑組Bax和Caspase-3 mRNA的表達水平顯著增加，Bcl-2 mRNA的表達水平顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而SAEE+模擬劑組Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的表達水平與模型組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表6 各組細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達的比較（±s）

表6 各組細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達的比較（±s）

組別空白組模型組SAEE組模擬劑組SAEE+模擬劑組Bax/GAPDH 1.00±0.03 2.47±0.37△1.21±0.11□3.53±0.36□2.31±0.26 Bcl-2/GAPDH 1.00±0.02 0.47±0.12△1.42±0.31□0.23±0.06□0.51±0.11 Caspase-3/GAPDH 1.00±0.04 2.18±0.29△1.31±0.19□3.77±0.21□2.04±0.16

3 討論

血管內(nèi)皮細胞為緊貼血管內(nèi)壁的單層細胞，為血液和血管壁的分界細胞，對于維持血管穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。在循環(huán)因子和炎性因子的誘導(dǎo)下，內(nèi)皮細胞可出現(xiàn)活化和損傷，從而促進AS的形成［15］。細胞凋亡是細胞在生理或病理條件下激活細胞DNA內(nèi)切酶活性，從而導(dǎo)致細胞自發(fā)性死亡的過程，對于促進生物器官的發(fā)育和組織分化的穩(wěn)定具有重要的意義［16］。有研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣斑塊中內(nèi)皮細胞凋亡水平增加［17-18］。內(nèi)皮細胞凋亡導(dǎo)致細胞數(shù)量的減少使得內(nèi)皮通透性增加和完整性的破壞，引起脂質(zhì)沉積和遷移。在此基礎(chǔ)上，平滑肌細胞和單核細胞遷移至動脈內(nèi)膜，導(dǎo)致血管損傷和斑塊形成。此外，越來越多的研究證實內(nèi)皮細胞凋亡不僅可以促進不穩(wěn)定型心絞痛、急性冠脈綜合征等急性缺血性心臟病的發(fā)生，而且還能通過抑制血管再生阻礙血管功能的恢復(fù)［19-20］。細胞凋亡是由多種蛋白或細胞因子共同參與的復(fù)雜過程，其中促凋亡蛋白（如Bax）與抗凋亡蛋白（如Bcl-2）的平衡對于凋亡的調(diào)控具有重要的作用。Caspase-3是Caspase家族最重要的效應(yīng)型Caspase，一旦Bax的表達上調(diào)并促進Bax/Bax同源二聚體的形成，導(dǎo)致線粒體通性增加和細胞色素C的釋放，最終激活Caspase-3促進細胞凋亡［21-22］。本研究結(jié)果表明，SAEE能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的細胞凋亡，其作用主要是通過抑制Bax/Bcl-2/Caspase-3通路的激活。

MiRNA是一類長度約為18～25 nt的高度保守的非編碼RNA，其通過與靶基因3’非翻譯區(qū)的位點結(jié)合促進靶基因mRNA的翻譯抑制和降解，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因沉默的作用。已有研究證實，miRNA在膽固醇代謝、平滑肌細胞增生和血管內(nèi)皮細胞炎癥和損傷等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。MiR-150是一種和炎癥密切相關(guān)的miRNA，且與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)［23］。此外，有臨床研究表明，miR-150的表達水平在不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者外周血中顯著增高［24］。在本研究中，我們通過ox-LDL誘導(dǎo)構(gòu)建內(nèi)皮細胞損傷模型，結(jié)果顯示模型組中miR-150的表達水平顯著增加，而SAEE能夠抑制內(nèi)皮細胞中miR-150的表達水平。通過在SAEE基礎(chǔ)上聯(lián)合miR-150模擬劑結(jié)果表明，SAEE對細胞凋亡的抑制作用被顯著抵消。因此本結(jié)果提示SAEE主要是通過調(diào)控miR-150發(fā)揮抗凋亡作用的。

我們通過TargetScan網(wǎng)站預(yù)測ELK1是miR-150的潛在靶基因。ELK1是ETS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，在絲裂原刺激和絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)的基因表達中起關(guān)鍵作用［25］。ELK1具有多種生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞周期控制、凋亡和氧化應(yīng)激［26］。氧化應(yīng)激是內(nèi)皮細胞損傷后凋亡的常見誘因，本研究中ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷模型中氧化應(yīng)激水平顯著增加，ELK1表達水平顯著降低。而SAEE能夠上調(diào)細胞中ELK1的表達水平和SOD活性，降低MDA含量和LDH釋放量，從而發(fā)揮抗氧化、抑制凋亡的作用。

綜上所述，SAEE通過抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷模型中miR-150的表達，進而上調(diào)ELK1的表達水平，從而發(fā)揮抗氧化和抑制內(nèi)皮細胞凋亡的作用。