脊髓拴系綜合征終絲超微結構的觀察分析

蔣擎玉 尚愛加 高 干 陶本章 汪 匯 王培新 孫夢純 吳 言

脊髓拴系綜合征（tethered cord syndrome，TCS），又稱脊髓拴系，因先天發育異常，使短而增厚的終絲組織彈性降低，對脊髓施加過度的牽引力導致脊髓圓錐低位、馬尾神經受到牽拉，產生排尿和排便障礙、下肢感覺和運動障礙、足畸形等癥狀，隨著生長發育，癥狀也會逐漸加重[1]。早期對該病的認識不足，脊髓圓錐被定義為脊髓的末端，終絲則被認為是一束無功能的纖維組織，部分學者將其稱為“脊髓韌帶”，也有學者將其描述為脊髓的末端，更有學者將其視為“脊髓的殘余物”，忽略了終絲在TCS 發病機制中起到不可或缺的作用[2]。本文通過對比正常人與TCS終絲差異，探討TCS的發病機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇2021 年10 月～2022 年5 月手術切除的16例TCS病人的終絲標本，其中男5例，女11例；年齡3～69歲。16例均有大小便功能障礙及會陰區感覺減退，其中4例有明顯的下肢肌肉萎縮；腰骶部皮膚出現異常毛發增多1 例，實性包塊、異常毛發、先天性皮毛竇、骨贅以及色素沉著15例。MRI可見16 例圓錐位置均平齊或低于腰2 椎體下緣。1 例正常終絲取自腰骶部神經鞘瘤，其終絲與神經鞘瘤粘連緊密，難以分離，同腫瘤一并切除。為預防馬尾神經損傷，在電生理監測技術保護下，取新鮮終絲。3 例有肉眼可見的與脂肪交織混雜的終絲組織。考慮到TCS通常伴有圓錐低位，為避免脊髓損傷，均取骶1椎體水平及以下硬膜囊內終絲。本文經病人及其家屬知情同意并通過醫院倫理委員會批準。

1.2 組織染色

1.2.1 HE染色 將石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精脫蠟水化，蘇木素染液染細胞核，85%、95%的梯度酒精脫水，伊紅染液染細胞質，無水乙醇、二甲苯透明后，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.2 天狼猩紅染色 將石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精脫蠟水化。天狼猩紅染液（武漢賽維爾生物科技有限公司）染色，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并分析。

1.2.3 網狀纖維染色 將石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精脫蠟水化。酸化液氧化（0.5%高錳酸鉀與0.5%硫酸1:1 混勻），超純水浸洗。滴加2%草酸漂白，超純水浸洗。滴加網狀纖維染液F（武漢賽維爾生物科技有限公司）避光媒染，超純水浸洗。滴加網狀纖維孵育液避光處理，超純水浸洗。滴加10%中性甲醛液避光還原，肉眼觀察組織未出現黃棕色時，可延長作用時間。超純水浸洗，無水乙醇、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并分析。

1.2.4 間二苯酚品紅染色 將石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精脫蠟水化。間苯二酚品紅染液A室溫浸染，流水沖洗至流水無色。1%鹽酸酒精分化液快速分化，顯微鏡觀察到清晰的紫色的彈力纖維，背景淡紫色至幾乎無色。間苯二酚堿性品紅染液B 與間苯二酚堿性品紅染液C 混合染色，無水乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠濕封，顯微鏡觀察并分析。

1.3 電鏡檢測

1.3.1 透射電鏡檢測 新鮮組織確定取材部位，盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機械損傷，1～3 min內取樣，大小1 mm3。0.1 M磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min。隨后，0.1 M 磷酸緩沖液（pH 7.4）配制的1%鋨酸避光室溫固定2 h。0.1 M 磷酸緩沖液（pH7.4）漂洗3 次，每次15 min。次入30%-50%-70%-80%-95%-100%-100%酒精脫水（每次20 min），100%丙酮脫水兩次（每次15 min）。812 包埋劑包埋，37 ℃烤箱過夜，60 ℃烤箱聚合48 h，超薄切片機（60～80 nm）超薄切片，150 目方華膜銅網撈片。2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min；70%酒精清洗3 次；超純水清洗3 次；2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；超純水清洗3次，濾紙稍吸干。銅網切片放入銅網盒內室溫干燥過夜。最后透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.3.2 掃描電鏡檢測 取材同透射電鏡。0.1 M 磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min。0.1 M 磷酸緩沖液（pH 7.4）配制1%鋨酸室溫避光固定1～2 h。0.1 M 磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3 次，每次15min。30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精依次脫水，每次15 min，乙酸異戊酯脫水15 min。臨界點干燥儀內干燥。隨后，導電碳膜雙面膠上放入離子濺射儀樣品臺上進行噴金30 s。掃描電子顯微鏡下觀察。

2 結果

HE染色：正常終絲絕大部分由松散的結締組織組成，膠原纖維主體呈粉紅色，未見藍染的細胞核（圖1B）。TCS 終絲波浪狀的彈性纖維明顯減少，膠原纖維明顯增多，可見大量的脂肪細胞（圖1A），這很可能與TCS終絲增粗有關。

天狼猩紅染色：Ⅰ型膠原呈橘黃色或亮紅色，而Ⅲ型膠原呈綠色的細纖維，這說明TCS 終絲的大部分為較粗的縱向膠原束（圖1C、1D），以Ⅰ型膠原纖維為主，Ⅲ型則嵌入其中。

間二苯酚染色：正常終絲的彈力纖維呈紫紅色，大多縱向伸展，為保證終絲的伸展性，粉紅色膠原纖維則十分稀疏（圖1F）；然而TCS 終絲幾乎都是淺色的膠原纖維（圖1E）。

網狀纖維染色：正常終絲彈力纖維呈黑色（1H）。TCS 終絲多見空泡狀的脂肪細胞，偶見穿梭于膠原纖維中的黑色網狀纖維（圖1G）。

圖1 TCS終絲病理染色

掃描電鏡觀察：正常終絲纖維相對規整、粗細均勻。TCS 終絲多見大量排列紊亂、方向性差的膠原纖維，部分可見散在的脂肪細胞（圖2A）；終絲以縱向膠原纖維束為主，橫向纖維束穿插其中，互有間隔，纖維與纖維間不是緊密貼合（圖2B）。

透射電鏡觀察：終絲內部多見密集交錯的膠原纖維以及這些纖維的規律性的橫紋，偶可見成纖維細胞、脂肪細胞等（圖2C、2D）。

16 例Ⅰ型膠原纖維數量增多，占終絲的大部分；6 例可見脂肪細胞，3 例顯示小血管。16 例終絲掃描電鏡下可見雜亂無章且呈束的膠原纖維，5 例Ⅰ型膠原纖維增粗、變形，5例可見脂肪細胞。16例終絲透射電鏡可見縱橫交錯的膠原纖維以及有規律的橫紋，其中1例可見成纖維細胞。

3 討論

TCS 最早于19 世紀被發現。然而，直到1953年，Garceau[3]才首次描述了終絲綜合征，并推斷可能是異常增厚的終絲過度牽引脊髓從而產生臨床癥狀。此后于1981 年，Yamada 等[4]經動物研究后得出終絲牽拉后產生脊髓神經細胞的功能障礙可能是線粒體氧化消化及代謝損傷所致。20 多年后，George等[5]對比了正常人和TCS 終絲，確認大量室管膜細胞、神經和膠質組織的存在，顛覆了以往僅將終絲視為韌帶的錯誤認識[6]。

目前認為引起TCS 的病因主要有：①先天神經系統發育畸形[7]。遠端神經管由尾部細胞團發育形成，發展成脊髓圓錐、馬尾和終絲，其異常可能導致病理性終絲形成，增加未來拴系的可能性。②黏連、炎癥或硬膜內手術后多見[8]，常拴系于硬膜背側。有學者分析終絲的蛋白組學，通過對比正常終絲，提出差異蛋白可能參與異常的脂質等代謝，從而使終絲發生病理改變[9]。關于原發性TCS的分型，一直充滿爭議。目前，國內較為廣泛接受的是Gabriel 等[10]的分型：脊髓脊膜膨出修復術后型；蛛網膜粘連型；終絲緊張型；脂肪瘤型；脊髓縱裂畸形型。而尚愛加等[11]根據多年治療兒童TCS 的經驗，將此分型進一步修改完善：脊髓脊膜膨出修復術后型；脊髓脊膜膨出型；終絲緊張型；脂肪瘤型；脊髓縱裂畸形型。目前，TCS 的主要治療方法是終絲切斷術，尤其是伴有臨床表現的病人[12]。因為脊髓圓錐位置正常的病人也可能伴有終絲高張力的現象，無論終絲外觀看起來是否正常，早期終絲切斷都是首選的治療方法[13，14]。

本文以TCS 終絲為研究對象，采用電鏡和染色技術對終絲結構進行細致觀察，探討TCS 終絲彈性減退、張力增大的機制。Chrenek等[15]在顯微鏡下觀察發現，正常終絲可見室管膜細胞、神經膠質和神經元等原始成分。終絲具有狹長的中央管，該管由室管膜細胞排列，同時被成纖維細胞、神經元和膠質細胞包圍，形成典型的灰質。有髓纖維和無髓纖維在終絲周圍的白質中呈島狀分布。本研究發現TCS病人MRI 顯示終絲張力明顯增大、圓錐低位的原因可能是Ⅰ型膠原纖維、彈性纖維以及網狀纖維的含量變化，與此同時大量的脂肪組織浸潤其中可能是終絲彈性下降的原因。文獻報道，哺乳動物Ⅰ型膠原蛋白是皮膚中主要的膠原蛋白類型，占皮膚膠原蛋白的80%～90%，由真皮中成纖維細胞產生。深度創傷會導致疤痕。疤痕主要由過度合成和雜亂無章的Ⅰ型纖維組成。若在重組過程中，有神經參與其中，則膠原纖維排布得井然有序[16]。這是否是TCS病因之一有待進一步論證。

除了終絲，脂肪浸潤也可見于肌肉中。Xu 等[17]研究脂肪浸潤損傷后的骨骼肌中發現的主要細胞群包括成纖維細胞和脂肪組細胞，證實PI3K/AKT 和MAPK信號通路在內的脂質代謝途徑改變了肌肉中的脂肪酸組成。張宇等[9]在終絲蛋白組學的研究中發現載脂蛋白A1 的表達上調。這表明當神經管發育異常時該蛋白有參與抑制高密度脂蛋白受體SRB1的的作用[18]。這與TCS病因一致。

綜上所述，本研究結果表明MRI 顯示的具有較高張力的終絲在顯微結構下多由于彈性纖維、網狀纖維減少，Ⅰ型膠原纖維及脂肪組織異常增加，最終使得終絲彈性減退、張力變大，從而導致大小便功能障礙、下肢肌肉萎縮等臨床表現。本研究也存在諸多不足，如樣本量不足以及正常終絲較難取得等問題，所觀察的微觀結構可能未必全面。