GeneXpert MTB/RIF、MGIT960液體培養法在胸腔積液結核分枝桿菌檢測中的應用*

劉 王亭，羅 倩，陳 娟，梁 穎，伍仕敏△，何 柳，樊 毅

1.湖北省武漢市金銀潭醫院檢驗科，湖北武漢 430023；2.長江航運總醫院檢驗科，湖北武漢 430014

肺外結核是肺部感染后結核分枝桿菌及其自溶產物、代謝產物血源性播散，進入胸腔、脊柱、泌尿系統引起的炎癥，占所有結核病的10%～20%[1]。結核性胸膜炎(TBP)作為第二常見的肺外結核，是指胸腔感染結核分枝桿菌后發生的高度過敏性炎性病變，該病可引起胸膜通透性增強，導致炎性滲出物增多，易出現胸腔積液[2]。胸腔積液中結核分枝桿菌數量較少，實驗室輔助檢查陽性率較低，臨床上常用的超聲檢查也存在一定局限性。因此，選擇一種科學、準確、快速的檢測方法對TBP的診斷具有非常重要的意義。GeneXpert MTB/RIF是由美國塞沛公司研發的一項基于巢式實時熒光PCR法的體外診斷技術，2013年被世界衛生組織(WHO)推薦用于肺外結核診斷，是一種新型分子診斷方法[3]。目前，臨床上該方法對TBP的診斷價值報道較少，本研究擬回顧性分析2019年8月至2020年7月武漢市金銀潭醫院結核病區收治的386例疑似和確診結核病患者胸腔積液標本的GeneXpert MTB/RIF、MGIT960液體培養法檢測結果，旨在探討這兩種方法對臨床TBP早期診斷和治療的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年8月至2020年7月武漢市金銀潭醫院結核病區疑似和確診結核病患者(包括肺結核、TBP和其他肺外結核)386例，彩超引導下進行胸腔穿刺，獲得胸腔積液標本，其中男305例，女81例，平均年齡(27.5±4.5)歲。所有入選病例均符合中華人民共和國衛生行業標準《肺結核診斷標準》[4]中肺結核、肺外結核的診斷標準。未排除同時有結核伴其他可能引起胸腔積液疾病的患者。TBP的診斷標準：(1)具備TBP影像學改變特征及胸腔積液或胸膜病理學檢查符合上皮細胞樣肉芽腫性炎癥表現；(2)具備TBP影像學改變特征及胸腔積液病原學檢查陽性或分枝桿菌培養陽性且菌種鑒定為結核分枝桿菌復合群，或符合分子生物學檢查結果(結核分枝桿菌核酸檢測陽性)。

1.2儀器與試劑 美國賽沛公司GeneXpert MTB/RIF儀及相應試劑盒、BD公司BACTEC MGIT960全自動結核培養系統、雅培c16000全自動生化分析儀、寧波瑞源腺苷脫氨酶(ADA)測定試劑盒。

1.3方法

1.3.1GeneXpert MTB/RIF 采取膜過濾法提取核酸，通過超聲破碎細胞，然后通過濾膜來分離蛋白和核酸。不同性狀的胸腔積液標本先進行前處理，取標本離心后沉淀物約1 mL，先加入1～2 mL標本消化液(試劑盒自帶)，如標本蛋白含量過高或者為膿性標本，可適當增加標本消化液量，使標本完全液化，振蕩混勻后靜置15～20 min后進行操作。取液化后的標本加入反應盒指定孔，避免氣泡，盡快上機進行檢測。檢測完成后軟件可自動判讀結果，判斷待測標本中是否檢出結核分枝桿菌復合群，如果檢出，同時判斷是否檢出利福平耐藥基因。

1.3.2結核分枝桿菌培養 待檢標本離心后取沉淀物，先加入標本體積1.0～1.5倍4%NaOH，充分振蕩后靜置15～20 min，再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至50 mL，顛倒混勻后4 ℃ 3 000×g離心15～20 min，棄去上清液，加入2～3 mL PBS重懸，取500 μL加至MGIT960結核分枝桿菌培養系統液體培養管，培養管中預先加入配套添加劑和雜菌抑制劑，放入自動培養儀進行培養。待機器陽性報警后取出陽性培養管，取沉淀物進行抗酸染色，鑒定是否有結核分枝桿菌復合群生長。

1.3.3全自動生化分析儀檢測ADA 嚴格按ADA測定試劑說明書操作。標本采用血清或血漿，采血后應及時分離，分離后立即檢測，避免溶血。本試驗操作采用速率法，使用配套的校準品繪制校準曲線，采用配套的質控品，控制相對偏差在質控品偏差范圍內。試驗結果的計算：ADA活性(U/L)=標準濃度×(ΔA測定/ΔA標準)。

1.4分組 根據《全國臨床檢驗操作規程》(第4版)[5]相關內容，以ADA>40 U/L作為鑒別結核性積液的標準，將386例患者分為3組:第1組(非結核性積液)為ADA≤40 U/L，第2組(結核性積液)為ADA>40 U/L，第3組為膿性胸腔積液，不能進行ADA檢測。

2 結 果

2.1全自動生化分析儀檢測ADA的活性 在386例患者中，ADA檢測結果為(37.0±14.0)U/L。其中，第1組(非結核性積液)有219例，ADA檢測結果為(20.5±17.5)U/L；第2組(結核性積液)有145例，ADA檢測結果為(59.5±11.5)U/L；第3組(膿性胸腔積液)22例，因膿液黏稠，不能在全自動生化分析儀上進行ADA檢測。

2.2GeneXpert MTB/RIF和MGIT960液體培養法檢測陽性率比較 在386例患者中，GeneXpert MTB/RIF共檢測出陽性60例，陽性率為15.54%(60/386)，MGIT960液體培養法共檢測出陽性21例，陽性率為5.44%(21/386)。GeneXpert MTB/RIF檢測陽性率明顯高于MGIT960液體培養法(χ2=14.52，P<0.05)。

2.33組GeneXpert MTB/RIF和MGIT960液體培養法檢測結果 在3組患者中，GeneXpert MTB/RIF檢出結核分枝桿菌復合群的陽性率分別為3.20%、24.83%和77.27%；MGIT960液體培養法檢測陽性率分別為2.74%、8.28%和13.64%。GeneXpert MTB/RIF在結核性積液、膿性胸腔積液中檢測結核分枝桿菌復合群的陽性率明顯高于MGIT960液體培養法(χ2=14.38、17.97，P<0.05)。見表1。

表1 兩種方法檢出結核分枝桿菌復合群的情況比較

2.43組GeneXpert MTB/RIF和MGIT960液體培養法檢測陽性標本分析 如表2所示，將采用MGIT960液體培養法檢測為陽性的標本21例進行GeneXpert MTB/RIF檢測發現，3組共檢測出陽性11例，陰性10例。兩種方法檢測陽性結果的符合率為52.38%(11/21)。

表2 MGIT960液體培養法陽性標本與GeneXpert MTB/ RIF檢測結果比較(n)

3 討 論

結核病是嚴重危害人類健康的傳染病之一，其傳染性和致死性較高。結核病類型眾多，不同類型疾病病程及耐藥性區別較大。TBP作為第5種類型的結核病，早期對其進行鑒別診斷對于后續的治療有重要意義[6]。作為“金標準”的結核分枝桿菌培養，具體操作是對患者痰液標本或胸腔積液標本進行結核分枝桿菌培養，但培養所需時間較長，檢出陽性率較低，易延誤治療時間[7]。

胸腔積液是TBP早期臨床常見癥狀之一，與惡性胸腔積液等非結核性胸腔積液難以鑒別。當結核分枝桿菌侵犯胸膜，或者在體內其他結核病灶的作用下，都會引發胸腔積液。這種積液通常是由結核分枝桿菌及其代謝產物引起的遲發型超敏反應所致，胸腔積液中結核分枝桿菌菌量較低，活性不足，采用病原學培養方式確診率低[8]。胸腔積液ADA檢測是目前臨床用于結核性胸腔積液的輔助診斷方法之一，其對于鑒別診斷結核性與非結核性胸腔積液具有重要價值[9]。因此，根據《全國臨床檢驗操作規程》(第4版)要求，本研究以ADA>40 U/L作為判斷結核性積液的標準[5]。MGIT960液體培養法作為改良的液體培養結核分枝桿菌的方法，相比傳統的羅氏培養，明顯縮短了檢出結核分枝桿菌的培養周期，但仍需20 d左右才能獲得培養結果，仍然不能滿足臨床對TBP早期診斷和治療的需求[10]。

GeneXpert MTB/RIF于2010年得到WHO的認可并推薦用于結核病的診斷[11]，其采用封閉式自動化系統，不僅能確保檢測中的生物安全，操作也更加簡便，更能夠縮短檢測時間(2 h內出結果)，在輔助臨床結核病的診斷中具有快速、安全、便捷的優勢[12]。本研究發現，GeneXpert MTB/RIF對胸腔積液結核分枝桿菌復合群檢出的陽性率(15.54%)明顯高于MGIT960液體培養法檢測結果(5.44%)，差異有統計學意義(P<0.05)。進一步研究發現，GeneXpert MTB/RIF在結核性積液、膿性胸腔積液中檢出結核分枝桿菌復合群的陽性率明顯高于MGIT960液體培養法(P<0.05)。因此，胸腔積液GeneXpert MTB/RIF檢測對臨床TBP的早期診斷具有重要的意義。

進一步的研究發現，在21例MGIT960液體培養法陽性標本中，GeneXpert MTB/RIF檢測結果與其的符合率僅為52.38%，推測可能與不同患者胸腔積液形成的位置、性狀、病灶中結核分枝桿菌的活性以及這兩種方法學的靈敏度有關。這也表明，雖然目前結核分枝桿菌培養是結核病診斷的“金標準”，但靈敏度有限，其“金標準”的光環也有待商榷。

目前，GeneXpert MTB/RIF和MGIT960液體培養法都是WHO推薦的結核病實驗室診斷中非常重要的兩種診斷試驗。本研究結果表明，MGIT960液體培養法檢測胸腔積液標本的陽性率

明顯低于GeneXpert MTB/RIF，兩種方法陽性結果也無明顯一致性。因此，建議在懷疑TBP的胸腔積液標本中，可以將兩種方法聯合應用以提高結核分枝桿菌的檢出率，這對于臨床TBP的早期診斷和治療有重要意義。