HLA-DQB2基因多態性與中國西部人群抗結核藥物致肝損傷的關聯性研究

江 碩,趙珍珍,周 娟,應斌武

四川大學華西醫院實驗醫學科,四川成都 610000

結核病是威脅人類健康的全球流行性疾病，中國作為高結核病負擔國，控制結核病發病率，降低致殘率及致死率尤為重要。抗結核藥物致肝損傷(ATDH)是抗結核藥物治療期間出現的嚴重不良反應，將導致患者治療效果不佳、治療中斷，極大地增加患者的致殘率和病死率[1]。目前臨床治療結核病的一線藥物包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇及鏈霉素，根據地域及納入排除標準不同，2%～28%的患者可出現ATDH[2]。目前關于ATDH遺傳危險因素的研究主要集中于藥物代謝酶及轉運蛋白，包括細胞色素P450家族2E1(CYP2E1)、N-乙酰轉移酶-2(NAT2)、谷胱甘肽S-轉移酶[谷胱甘肽S-轉移酶mu1(GSTM1)和谷胱甘肽S-轉移酶β1(GSTT1)]和SLCO1A2[3-4]。研究表明，先天性及適應性免疫系統參與是導致藥物致肝損傷后肝細胞死亡的原因之一，細胞凋亡過程中細胞因子及CD4+T細胞被免疫反應激活，對肝細胞產生殺傷作用，參與反應的活化T細胞主要受主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ類及Ⅱ類分子調控[5-6]。人類白細胞抗原(HLA)是機體免疫反應的重要組成部分，有研究報道HLA基因多態性與藥物致肝損傷的發生密切相關[7-8]。目前，較少有研究報道人類白細胞抗原DQB2(HLA-DQB2)與ATDH發生有關，本研究旨在探討中國西部漢族人群HLA-DQB2基因多態性與ATDH發生、發展之間可能存在的關聯，以期為臨床醫生監測患者肝毒性并預測ATDH的發生提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究中使用的所有樣品均來自本院實驗醫學科“結核病研究”資源生物庫。共納入2016年12月至2018年4月本院1 060例高度懷疑為結核病的患者。試驗開始前，均獲得患者及家屬知情同意。所有受試者均接受6～8個月一線抗結核藥物聯合治療。方案包含兩個連續階段：第1階段為開始治療的前2個月，使用異煙肼(300 mg/d)、利福平(600 mg/d，若體質量<50 kg)、吡嗪酰胺(1 500 mg/d)和乙胺丁醇(750 mg/d)；第2階段(后4個月)使用相同劑量的異煙肼、利福平和乙胺丁醇進行繼續治療。剔除依從性差、失訪和轉用二線藥物的患者后，共納入746例結核病患者，其中包括118例ATDH患者(ATDH組)和628例非ATDH受試者(非ATDH組)。根據結核病指南[9]，所有患者均通過臨床癥狀、微生物和(或)影像學證據等進行結核病確認。本研究得到了本院臨床試驗和生物醫學倫理委員會的批準。

1.2ATDH診斷標準 本研究納入的所有ATDH病例均符合《美國傳染病學會臨床實踐指南：藥物敏感結核病的治療》[10]推薦的納入標準：(1)使用抗結核藥物治療前患者血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、血清堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉移酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)均正常；(2)在治療過程中，患者出現血清ALT或AST水平升高，為正常范圍上限(ULN)3倍(120 IU/L)及以上，并伴有肝炎癥狀及體征，如惡心、發熱、黃疸、嘔吐及腹痛，或血清AST或ALT水平為ULN 5倍(150 IU/L)及以上；(3)血清ALP水平為ULN 2倍(80 IU/L)及以上，且伴血清GGT水平升高；(4)血清ALT、AST或ALP水平升高為ULN 3倍(120 IU/L)及以上，同時伴有血清TBIL為ULN 2倍(56 μmol/L)及以上，但沒有肝炎癥狀或不符合吉爾伯特綜合征診斷。

1.3方法

1.3.1臨床資料收集 通過電子病歷系統收集患者所有數據，包括人口統計學資料、常見臨床癥狀(發熱、體質量減輕、盜汗、食欲不振、乏力等)及實驗室指標。實驗方案要求本研究的所有參與者在接受抗結核治療后的前2月每2周進行1次臨床實驗室血液檢測，后4個月每月檢測1次直到治療結束。此外，還叮囑患者注意肝毒性癥狀及體征，包括黃疸、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛等，臨床醫生負責鑒別相關癥狀并進行實驗室血液檢查，記錄與肝損傷相關的實驗室指標，以評估ATDH。

1.3.2候選基因多態性選擇及基因分型 HLA-DQB2基因變異數據來自dbSNP數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)，根據以下規則：(1)中國北京漢族人群的次要等位基因頻率(MAF)為0.05或以上；(2)排除連鎖不平衡≥97%的單核苷酸多態性位點(SNPs)。本研究最終選擇了6個SNPs(rs2395253、rs11759423、rs1573646、rs6902723、rs35439528、rs6925976)。

每例患者采集3 mL EDTA抗凝全血，采用德國Qiagen公司提供的QIAamp DNA Blood Mini Kit核酸提取試劑盒，嚴格按照試劑盒操作指南進行DNA提取。使用定制的48-Plex SNPscanTMKit(上海天昊生物科技公司)試劑盒進行SNPs基因分型。為保證基因分型質量，隨機抽取所有標本的10%進行重復基因分型。

2 結 果

2.1患者臨床特征與實驗室指標 本研究共納入746例患者，均為漢族。本研究中ATDH的發生率為15.82%(118/746)。ATDH組和非ATDH組的性別、年齡、體質量指數(BMI)、乙型或丙型肝炎病毒感染情況、保肝藥物的使用率、吸煙情況等比較，差異無統計學意義(P>0.05)。ATDH組中104例患者為首次接受抗結核治療，均未使用過保肝藥物。受試者的全身癥狀中發熱和體質量減輕患者所占比例在兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。ATDH組患者ALT、AST、ALP、GGT、TBIL水平明顯高于非ATDH組患者(P<0.05)。 見表1～2。

表1 研究對象的一般資料

表2 研究對象臨床特征及實驗室結果

2.2HLA-DQB2基因多態性與ATDH易感性分析

2.2.1基因分型結果 將SNPs位點分型不成功的部分研究對象剔除后，最終納入分析的rs1573646、rs2395253、rs6902723、rs11759423、rs35439528、rs6925976位點的ATDH組例數分別為115、117、118、116、116、117例，非ATDH組的最終分析例數為618、627、628、628、628、628例。表3中詳細列出各SNPs信息，HLA-DQB2基因型分布中非ATDH患者SNPs均未偏離HWE平衡(所有位點P>0.05)。

表3 HLA-DQB2基因的一般特征

2.2.2SNPs等位基因和基因型分析 在納入分析的6個SNPs位點中，rs1573646的等位基因頻率分布及基因型頻率分布在兩組間的差異均有統計學意義(P<0.05)。rs1573646 A等位基因攜帶者相對于C等位基因攜帶者，可能潛在性地增加了ATDH發生風險(OR=1.369，95%CI1.002～1.871，P<0.05)。兩組間HLA-DQB2基因6個SNPs的等位基因和基因型分布見表4。

表4 HLA-DQB2 等位基因、基因型在兩組間分布情況

為進一步探討兩組間HLA-DQB2基因多態性分布在遺傳水平上的差異，本研究構建了加性、顯性和隱性遺傳模型進行分析，分析結果見表5。隱性模型顯示，rs1573646 AA基因型相較于AC/CC基因型具有較高的ATDH發生風險(OR=2.227，95%CI1.183～4.190，P=0.013)；rs6902723 GG基因型相較于GA/AA基因型具有較高的ATDH發生風險(OR=2.184，95%CI1.163～4.099，P=0.015)。經Bonferroni校正后，發現攜帶rs1573646和rs6902723的患者在隱性模型中與ATDH發生風險增加有關，剩余的HLA-DQB2基因的4個SNPs在加性、顯性、隱性遺傳模型，以及單倍體分析中均未發現ADTH發生風險差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2.3單倍體構建 本研究進行了連鎖不平衡分析和單倍體構建。將成對R2≥0.80視為高度連鎖不平衡。6個SNPs中，除rs6925976外，其余SNPs間存在強連鎖不平衡。本研究在rs1573646和rs6902723中構建了單倍型，并分析了兩個單倍型(CA和AG)。兩組中所有單倍體頻率見圖1，結果顯示rs2395253與rs6902723單倍型分布在ATDH組與非ATDH組差異均無統計學意義(P>0.05)。

注：Block代表在這兩個SNPs間構建了單倍型；結果顯示它們是高度相關的。

3 討 論

ATDH是導致結核病患者不良預后的主要原因。長期以來，宿主的遺傳易感性一直被認為是藥物不良反應出現個體化差異的原因。對HLA-DQB2基因多態性與抗結核藥物引起肝損傷易感性的研究有助于ATDH易感基因的發現和驗證。筆者研究了HLA-DQB2的基因多態性，探索其是否與漢族人群獲得ATDH具有潛在關系。本研究發現HLA-DQB2位點rs1573646與ATDH易感性有潛在關系，其他位點無統計學意義(P>0.05)。

HLA-DQB2屬于HLA Ⅱ類B鏈旁系同源物家族，位于人類6號染色體(6q21.32,32741391-32838770)，是人類免疫系統的重要組成部分，通過呈遞源自細胞外蛋白的肽類在免疫系統中發揮核心作用。結核病是一種與免疫系統密切相關的疾病，與其他藥物致肝損傷相比，免疫系統可能在ATDH中發揮獨特的作用。有研究表明，HLA-DR+CD4+T細胞可能通過拮抗輔助性T細胞介導的機體對結核分枝桿菌的特異性免疫而導致疾病相關炎癥[11]。HLA單倍型關聯表明，藥物導致的肝損傷與適應性免疫反應的遺傳易感性以及藥物及其代謝物相關的抗原呈遞和識別有關[12]。一項全基因組關聯研究(GWAS)發現，由HLA參與的適應性免疫反應被激活可能是藥物致肝損傷的發病原因，證明HLA多態性與藥物致肝損傷的發生有相關性[13]。阿莫西林-克拉維酸誘導的肝損傷與HLA-DQA1*01∶01、HLA-DQB1*05∶01和HLA-DRB1*15∶01的等位基因變異密切相關。有研究者發現攜帶相關基因的患者與未攜帶者相比，服用阿莫西林-克拉維酸后發生肝毒性的風險可增高 10～80倍。HLA-B57*01基因多態性被證明與氟氯西林引起的肝損傷有關[14]。還有研究報道，在東南亞人群中，卡馬西平引起的藥物性肝損傷與攜帶HLA-B*15∶02的患者密切相關[15]。HLA-DRB1*16∶01、HLA-DQB1*05∶02基因攜帶者使用氟西丁治療后發生藥物致肝損傷風險增加[16]。

HLA-DQB2表達的蛋白質產物在HLAⅡ類抗原分子中出現[17]，HLAⅡ類分子可將抗原肽呈遞給CD4+T細胞。當藥物本身或異常藥物代謝物進入肝臟、激活肝臟樹突狀細胞后，形成藥物修飾肽-HLA膜分子，引起損傷相關分子釋放，使樹突狀細胞表面膜表型改變，在B7分子及趨化因子受體CCR7等因子參與下，成為成熟的抗原呈遞分子，進入全身血液循環，激活更多CD4+T細胞進入肝臟[18]。最終進入肝臟中的具有活化效應的T細胞通過氧化應激、免疫反應等不同機制導致肝損傷，包括產生多種類型的CD4+T細胞，例如：促炎細胞因子[干擾素(IFN)-γ、白細胞介素(IL)-17等]及促過敏的細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13等)，同時激活CD8+T細胞對含有穿孔素和顆粒酶的顆粒進行胞吐作用或產生由FasL介導的CD4+和CD8+T細胞的殺傷作用，引起肝細胞損傷[19]。本研究中，HLA-DQB2基因SNPs位點rs1573646 A等位基因攜帶者在接受抗結核藥物治療后表現出ATDH發生風險的增加，可能原因為抗結核藥物或其代謝產物在肝臟中與HLA-DQB2基因SNPs位點rs1573646 A等位基因的肽進行了優先關聯，改變其抗原肽的HLA結合位點，導致呈遞的抗原肽的所有成分發生改變，最終引起肝臟損傷[20]。

在ATDH的研究中，多項研究發現HLA-DQB1*02∶01、HLA-DQB1*05∶02、HLA-DQA1*01∶02、HLA-DRB1*03的基因多態性與發生ATDH的風險密切相關[7-8]。KIM等[21]發現攜帶HLA-CW*0401基因人群與抗結核藥物誘導的超敏反應綜合征(HSS)具有相關性。根據以上證據，推測HLA-DQB2基因多態性可能與ATDH的發生風險有關。本研究顯示，SNPs rs1573646、rs6902723可能與ATDH發生風險增加有潛在關聯。選定的余下4個HLA-DQB2基因SNPs位點(rs2395253、rs11759423、rs35439528、rs6925976)經過等位基因頻率、基因型分布，以及3種遺傳模型分析，發現兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。

本研究有以下不足：(1)納入的樣本量有限，本研究僅招募了118例患者，沒有進一步將ATDH患者細分為肝細胞亞組、膽汁淤積亞組和混合亞組。(2)單基因多態性對ATDH的發生、發展影響有限，仍需進一步探討更多HLA相關基因及環境等客觀因素與ATDH發生的關系。ATDH是一種嚴重且復雜的藥物不良反應，涉及多個器官及不同機制。由感染、炎癥或其他氧化應激引起的復雜應激反應可能共同刺激免疫反應并引發由免疫介導的肝細胞死亡[5,22]。

綜上所述，本研究發現SNPs rs1573646、rs6902723可能與ATDH的發生風險增加有潛在關系，余下4個HLA-DQB2基因SNPs位點(rs2395253、rs11759423、rs35439528、rs6925976)沒有發現與ATDH的發生、發展在統計學分析中具有的關聯。關于HLA-DQB2基因與ATDH的發生、發展研究仍需繼續探討。