MLPA技術在α-珠蛋白生成障礙性貧血罕見基因型患者及家系分析中的應用*

劉發娣，盧 娟，周紅平，王 珂，胡 蓉，柯江維△

1.江西省兒童醫院檢驗科，江西南昌 330006；2.南昌大學醫學部基礎醫學院，江西南昌 330006

α-珠蛋白生成障礙性貧血(簡稱地貧)是人類常見的單基因遺傳病之一[1]，臨床以小細胞低色素性貧血為主要表現，臨床表型包括幾乎無癥狀的攜帶者至致死性溶血性貧血患者[2]。α-地貧主要分布在熱帶和亞熱帶地區，在中國，則以廣西、廣東、福建、江西、四川和海南為主，地域性強[3-8]。α-地貧是由于編碼珠蛋白α鏈的α-珠蛋白基因簇出現片段缺失或(和)點突變而引起，該基因簇位于人類染色體16p13.3，健康人每條16號染色體均有兩個α-珠蛋白基因。α-地貧患者的臨床表型與受累的α-珠蛋白基因個數直接相關，當一條染色體中兩個α-珠蛋白基因均失活時，為α0-地貧；而一條染色體中任意失活一個α-珠蛋白基因則稱為α+-地貧；兩條染色體僅失活一個α-珠蛋白基因的攜帶者往往表現為沒有臨床癥狀的靜止型；而失活兩個α-珠蛋白基因的患者主要表現為輕度貧血；若4個α-珠蛋白基因中有3個基因受累則表現為血紅蛋白H病；4個α-珠蛋白基因全部受累表現為Hb Bart′s胎兒水腫綜合征。

目前，珠蛋白基因檢測最常用的方法是跨越斷裂點聚合酶鏈反應(Gap-PCR)和反向斑點雜交技術。在我國，引起α-地貧的突變類型包括缺失型突變和點突變，--SEA是最常見的缺失突變類型，其次為-α3.7和-α4.2；而點突變則以αQS(Hb Quong Sze)、αCS(Hb Constant Spring)和αWS(Hb Westmead)為主。本文將闡述運用多重連接探針擴增(MLPA)技術對α-珠蛋白基因罕見的27.6 kb大片段缺失突變家系的檢測分析過程，而該突變為首次在江西籍人群中被發現并報道。

1 資料與方法

1.1一般資料 先證者，男，5歲9個月，江西景德鎮人，因發現貧血1年半來江西省兒童醫院就診。入院時，貧血面容，皮膚無黃染，口唇淡紅，口腔黏膜正常，未觸及肝脾腫大。患兒父親既往體健，系退伍軍人，無貧血癥狀。患兒母親貧血面容，懷孕期間曾3次暈倒。患兒有兩個姐姐，均體健，無貧血表現。

1.2方法

1.2.1標本采集與血液學分析 采集患兒及其家系成員外周血2 mL(EDTA-K2抗凝)，紅細胞相關參數分析采用血細胞分析儀(XN-1000，日本Sysmex公司)；血紅蛋白電泳及組分定量分析采用快速自動電泳分析系統(Capillarys Sebia-2,法國Sebia公司)。外周血基因組DNA提取采用外周血DNA提取試劑盒(廣東凱普生物技術有限公司)。

1.2.2反向斑點雜交 試驗采用廣東凱普生物技術有限公司的地貧檢測試劑盒(含α-地貧常見缺失突變、α-地貧常見點突變和β-地貧的常見點突變)，嚴格按照說明書操作。

1.2.3MLPA 采用P140-C1 HBA試劑(MRC-HOLLAND，荷蘭)，委托中翰金諾醫學檢驗所進行檢測。

1.2.4Gap-PCR 根據MLPA檢測結果，參考文獻[9]，委托上海捷瑞生物公司合成引物(F:5′-ATCTGAGGTGGCACACAAGCA-3′；R:5′-AGCCCCAA GTCATGGACTCAC-3)，運用Gap-PCR對患者及其家系成員進行擴增，引物水平為10 μmol/L，擴增體系為20 μL：其中2×PCR mix 10 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。擴增反應條件：95 ℃，3 min，1個循環；95 ℃ 50 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，同時將先證者PCR產物送廣東凱普生物技術有限公司進行基因測序。

2 結 果

2.1血液學分析 先證者及其家系成員的地貧篩查血液學指標如表1所示，先證者及其母親平均紅細胞體積(MCV)和平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)均顯著降低，為典型的小細胞低色素性貧血，且血紅蛋白A2(HbA2)均偏低，提示先證者及其母親可能是α-珠蛋白基因突變攜帶者；而先證者父親及其兩個姐姐血液學指標未見明顯異常。

表1 先證者及其家系成員的血液學和生化參數

2.2反向斑點雜交 如圖1所示，先證者α-地貧缺失突變對照點NP和點突變的正常對照點均未顯示，先證者父親未見常見的α-地貧缺失突變和點突變，先證者攜帶的--SEA缺失突變來源于母親，而先證者兩個姐姐的反向斑點雜交結果均未見異常。

圖1 反向斑點雜交法膜條探針排列順序及先證者家系成員檢測結果

2.3MLPA檢測結果 先證者樣本自346 nt探針至400 nt探針處均出現不同程度缺失，該缺失區域包含HBZ、HBZP1、HBAP2、HBAP1、HBA2、HBA1及HBQ1基因。根據試劑說明書可知184 nt探針至400 nt探針缺失為--SEA，包含HBAP1、HBA2、HBA1及HBQ1基因，而346 nt探針至337 nt探針缺失為-α27.6。見圖2。

注：A為MLPA技術檢測HBA基因的探針分布位置，灰色橫條代表- -SEA缺失的范圍(探針184～400 nt)，黑色橫條代表-α27.6缺失的范圍(探針346～337 nt)；B為先證者不同探針位置的拷貝數比值，其中比值在0.7～1.3為拷貝數正常，0.3～<0.7為雜合缺失，比值為0則是純合缺失，比值>1.3代表重復。

2.4Gap-PCR和基因測序結果 根據MLPA結果，于-α27.6缺失的兩側設計引物，通過Gap-PCR擴增，將產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，如圖3所示，1、2、5這3個泳道可見約1.7 kb的特異性條帶，分別是先證者及其父親和姐姐(小)；而3、4泳道顯示，先證者母親和姐姐(大)未攜帶該缺失突變。為了進一步明確患者的基因缺失位置，采用Sanger測序對Gap-PCR擴增產物進行測序，結果見圖4，缺失的范圍位于NG_000006.1:9079與NG_000006.1:36718之間，同時，兩個斷點之間還插入了AATCCC 6個堿基。

注：M為標志物；1為先證者；2為父親；3為母親；4為姐姐(大)；5為姐姐(小)；1.7 kb條帶為-α27.6缺失的特異性條帶。

注：缺失范圍見圖中標識，缺失堿基T與A之間插入了6個堿基。

3 討 論

α-地貧為最常見的常染色體隱性遺傳病，隨著基因檢測和診斷技術的不斷進步，越來越多罕見的α-地貧突變類型不斷被發現。目前，檢測α-地貧缺失突變最常用的方法是Gap-PCR[10]，結合瓊脂糖凝膠電泳或者反向斑點雜交實驗共同完成。臨床推廣的檢測試劑主要包括α-地貧的3種常見缺失類型和3種常見的點突變類型，涵蓋了國內約98%的α-地貧類型[11]。本文中的先證者在常規斑點雜交實驗中顯示，除了攜帶--SEA外，缺失突變的正常對照點以及3個點突變的正常對照點均沒有顯色，由于本實驗室所使用的檢測試劑中，α-缺失突變的正常對照點的同源序列來自α2基因，而3種常見的點突變也存在于α2基因中，因此，可以推測患者出現的罕見斑點雜交圖是因為患者一條染色體攜帶了--SEA缺失，而另一條染色體可能缺失了α2基因。

為了明確患兒所攜帶的α-珠蛋白基因突變型，本文選用MLPA技術進行檢測，MLPA技術是2002年由SCHOUTEN等[12]首先報道，該方法結合了DNA探針雜交和PCR擴增技術，可對待檢DNA序列進行定性和半定量分析，1次反應可檢測45個靶序列，適用于基因片段缺失或重復以及已知點突變的檢測，用于檢測已知與未知的大片段缺失型α-珠蛋白基因。MLPA技術檢測結果顯示，先證者所攜帶的是一種罕見的-α27.6缺失突變。

跨過-α27.6缺失范圍，在兩側設計引物，通過Gap-PCR可成功擴增出特異性條帶。根據該家系的電泳結果可以看出，先證者的-α27.6缺失突變來自父親，先證者的姐姐(小)也攜帶了該突變。通過對Gap-PCR產物進行Sanger測序，可準確判定缺失基因的斷點，將測序結果與NCBI GeneBank比對后發現，該家系的缺失突變與此前報道的多個攜帶者為同一突變類型[9,13-14]。盡管目前有多篇研究報道了-α27.6缺失基因型攜帶者或家系，但患者均來自中國福建省[9,13-14]。本文的患者為江西省景德鎮人，是江西省首次檢測到該突變的攜帶者，豐富了江西省地貧疾病突變譜，同時也為罕見α-地貧的基因診斷方法提供參考。

不同的突變類型導致患者貧血的臨床表型和機制可能不同[15]，本文中先證者的父親雖然也是-α27.6缺失基因型攜帶者，但他沒有血液學異常的表現，并且常規臨床檢測試劑又未能包含該缺失類型，因此，對于地貧的罕見基因型的發現與診斷，家系分析就顯得尤為重要。自從20世紀80年代開始，我國嚴格執行計劃生育政策后，大量獨生子女的出現導致大家系明顯減少，也使得此類罕見型突變的發現更加困難。就本文所研究的家系而言，患兒父母雖然同時攜帶α-珠蛋白基因缺失突變，但是只有患兒同時遺傳了父母雙方的地貧缺陷基因時，才會在常規篩查實驗中表現出異常的斑點雜交圖，而下一代中同時攜帶父親和母親兩種缺陷基因的概率僅為25%。事實也正如此，該患兒為家系中的第3個孩子，姐姐(大)珠蛋白基因未見異常，姐姐(小)則攜帶了與其父親一樣的罕見缺失突變，若沒有先證者的出生，那么該家系所攜帶的27.6 kb缺失突變也難以被發現。這可能是-α27.6缺失突變攜帶者罕見的原因之一。因此，筆者認為-α27.6缺失突變的人群攜帶率可能遠比實際發現的高。

綜上所述，對于罕見的α-地貧突變類型，特別是尚未報道的缺失突變類型，MLPA技術是一個良好的檢測手段。因此，當臨床發現可疑大片段缺失的地貧患者時，可先選擇MLPA技術對α-珠蛋白基因進行檢測，尋找可能出現缺失的部位，再針對基因缺失部位的兩端設計引物，進行Gap-PCR擴增和基因測序，便可進一步明確患者的基因型[9,16]。但是對于該家系先證者缺失了3個α基因，卻沒有血紅蛋白H帶(HbH)這一現象，雖然有文獻[17]談及，但具體的機制還不明確，還需要進一步研究探討。