NOD2受體在抗β2GPⅠ抗體誘導血小板炎性反應促血栓形成中的作用研究*

駱 杰，查才軍，張 平，王兆鑫，吳 言，張文靜△

1.同濟大學附屬第十人民醫院檢驗醫學科，上海 200072；哈爾濱醫科大學附屬第二醫院：2.檢驗醫學科；3.神經外科；4.超聲醫學科，黑龍江哈爾濱 150086

抗β2糖蛋白Ⅰ抗體(anti-β2GPⅠ)屬于抗磷脂抗體家族成員，是血栓發生、發展過程中起免疫調節作用的高危因素，但其調控血栓形成的機制目前尚不明確。以往的研究表明，anti-β2GPⅠ與其靶抗原β2GPⅠ結合形成anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物后，通過誘導血小板功能紊亂可使機體處于血栓前狀態，造成血栓形成前的第1次“打擊”；血栓前狀態發生之后，anti-β2GPⅠ誘導細胞發生炎性反應促發第2次“打擊”，最終導致血栓形成，提示炎性反應可能在anti-β2GPⅠ誘導的血栓形成中扮演了重要角色[1]。核苷酸結合寡聚域2(NOD2)受體是炎性小體家族成員之一，可表達于血小板細胞的細胞質中，研究表明NOD2受體可通過調節氧化應激反應促使神經細胞功能紊亂、促發并加重動脈粥樣硬化[2]。本研究旨在明確NOD2受體在anti-β2GPⅠ誘導血小板發生炎性反應進而促血栓形成中的作用機制，探討以NOD2受體為干預靶點對anti-β2GPⅠ誘導血栓形成的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年3月哈爾濱醫科大學附屬第二醫院經CT、MRI或動靜脈造影診斷為血栓且anti-β2GPⅠ陽性的患者69例為血栓組。排除標準：合并肝臟、腎臟等嚴重基礎疾病；合并凝血功能障礙疾病或血液疾病；合并其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤等。隨機選取同期常規體檢的78例健康者作為健康對照組。本研究通過醫院倫理委員會審核批準，所有研究對象均知情同意。

1.2儀器與試劑 小鼠抗人NOD2抗體，p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抗體、白細胞介素(IL)-1β抗體(美國Cell signaling公司)，IL-1β ELISA試劑盒(上海博奧公司)，cDNA反轉錄試劑盒(美國 Invitrogen 公司)，PCR試劑盒(Roche 公司)。NOD2引物(上海捷瑞公司)，姜黃素(山西玉寧生物科技有限公司)，SB203580、TAK242、β-actin(上海碧云天公司)。

1.3方法

1.3.1臨床數據收集 收集所有入組人員的性別、年齡資料；生化檢測指標：丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、γ-谷氨酰轉移酶、堿性磷酸酶、總蛋白、清蛋白、球蛋白、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、膽堿酯酶、尿素、肌酐、尿酸、葡萄糖、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇(Roche DPP生化分析儀)；白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、單核細胞計數、血紅蛋白、紅細胞計數、血小板計數(Sysmex XE5000血細胞分析儀)。

1.3.2血小板與血漿提取 收集血栓患者和健康者肘正中靜脈采集的枸櫞酸鈉抗凝全血標本，室溫160×g離心10 min，提取上清液，2 300×g離心10 min后分離上清液與沉淀，沉淀重懸于Tyrode′s緩沖液，上清液于-20 ℃凍存，備用[14]。根據實驗需要，將分離后的健康者血小板分為陰性對照組、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激組、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ加Toll樣受體4(TLR4)抑制劑TAK242組(anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+TAK242組)、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ加p38 MAPK抑制劑SB203580組(anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580組)和anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+姜黃素組。

1.3.3實時定量PCR(RT-PCR) 提取的血小板懸液中加入1 mL Trizol試劑，室溫靜置5 min后加入200 μL氯仿，渦旋振蕩器上充分振蕩混勻后室溫下靜置3 min，12 000 r/min離心15 min后吸取上清液，加入異丙醇500 μL，室溫靜置10 min，12 000 r/min離心10 min后棄去上清液。紫外分光光度計檢測沉淀中總RNA水平。Trans Criptor First Strand cDNA Synt hesis Kit反轉錄合成cDNA。加入NOD2引物，以β-actin為內參，根據Ct值計算2-ΔΔCt。

1.3.4ELISA 收集患者或健康人血漿，以及刺激血小板后的上清液，加入ELISA試劑盒檢測孔中，加樣量為50 μL。按照試劑盒說明書加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，37 ℃水浴60 min。清洗液洗滌5次后，分別加入底物A液和B液各50 μL，37 ℃避光水浴15 min，終止反應。酶標儀在波長450 nm處檢測樣品A值。以標準品水平繪制標準曲線，計算IL-1β水平。

1.3.5免疫印跡法(Western blot) 血小板經PIPA裂解后離心提取總蛋白，BCA法檢測蛋白水平。配制10%分離膠，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。200 V恒壓轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入小鼠抗人β-actin、TLR4、NOD2、ASK-1、p38 MAPK一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗小鼠二抗，37 ℃孵育1 h，增強化學發光(ECL)顯影。

1.3.6小鼠頸總動脈血栓模型 將小鼠分為陰性對照組、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ注射組和anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+姜黃素注射組。小鼠尾靜脈注射各組藥物，4%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉小鼠，仰臥固定，75%乙醇消毒，于頸正中線做縱向切口。鈍性分離小鼠頸部肌肉組織，暴露左側頸總動脈，長度約為5 mm。用棉球擦干頸動脈周圍殘留血液，于近心端和遠心端分別放置兩根結扎線，并在動脈下放置一塊塑料薄膜(5 mm×30 mm)用于保護血管周圍組織。將吸有10 μL 10% FeCl3的1 M濾紙片(3 mm×3 mm)放置于動脈下，連續刺激并觀察10 min。

1.3.7激光散斑超聲血流分析 將激光散斑超聲血流分析儀激光斑點對準分離出的小鼠頸總動脈，穩定1 min后，利用PIMSoft 軟件監測血流變化情況。以血管內持續2 min無血流通過作為動脈閉塞標志。

2 結 果

2.1兩組一般資料比較 對比健康對照組和血栓組的一般臨床資料，兩組研究對象血清尿酸、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、球蛋白、直接膽紅素、膽堿酯酶、血紅蛋白水平，淋巴細胞計數、單核細胞計數、紅細胞計數和血小板計數差異無統計學意義(P>0.05)；白細胞計數、中性粒細胞計數等差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。半數以上患者(57.97%)血清葡萄糖水平超過正常參考范圍(未在表1中體現)。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2健康對照組與血栓組外周血血小板NOD2受體mRNA表達和血漿IL-1β水平比較 與健康對照組相比，血栓組患者血小板NOD2受體mRNA表達和血漿IL-1β水平顯著升高(P<0.05)。見圖1。

注：A為RT-PCR法檢測外周血血小板NOD2受體mRNA表達；B為ELISA檢測外周血血漿IL-1β水平;*P<0.05。

2.3anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ對健康人血小板NOD2受體mRNA表達及IL-1β水平的影響 與陰性對照組相比，anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激組血小板NOD2受體mRNA表達增加(P<0.05)，復合物刺激血小板后上清液IL-1β水平顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注：A為RT-PCR法檢測刺激血小板后NOD2受體 mRNA表達；B為ELISA檢測anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激血小板后上清液IL-1β水平;*P<0.05。

2.4anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ通過TLR4調控NOD2/p38 MAPK通路影響血小板釋放IL-1β 與anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激組相比，TLR4抑制劑TAK242可部分抑制NOD2受體蛋白表達，顯著抑制p38 MAPK磷酸化和降低IL-1β水平；加入NOD2受體抑制劑姜黃素后，p38 MAPK磷酸化受到抑制，IL-1β水平下降；加入p38 MAPK抑制劑SB203580后，IL-1β水平顯著降低，NOD2受體表達未受影響。見圖3。

圖3 Western blot檢測血小板NOD2受體、p38MAPK和IL-1β表達

2.5姜黃素通過抑制NOD2受體緩解anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激后的小鼠頸總動脈血栓形成 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ注射組小鼠頸總動脈閉塞時間縮短，注射姜黃素可使anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導的血管閉塞時間顯著延長。見圖4。

注：白色方框內為小鼠頸總動脈，其中黑色為血管血流充盈狀態，灰色為血管缺血狀態。

3 討 論

anti-β2GPⅠ是導致抗磷脂綜合征(APS)患者血栓形成的高危因素，APS患者外周血內皮細胞黏附分子-1、組織因子、腫瘤壞死因子-α水平增高，提示APS患者體內細胞發生了促炎表型轉變[3-4]。血小板活化是血栓形成的始動因素，近年來，血小板在炎癥相關免疫反應中的重要作用逐漸得到重視[5-6]。

NOD2受體是一種模式識別受體，對自身免疫性疾病和炎性疾病具有調節作用[7-8]。NOD2受體可通過N末端天氨酸酶募集區域，調節巨噬細胞對低密度脂蛋白的攝取，促使動脈粥樣硬化斑塊中富脂質層面積增加，導致小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成和腦血栓形成。以上機制揭示了其在血栓性疾病發病機制中具有重要作用[2,9-10]。IL-1β是參與多種疾病發生、發展的急性炎癥因子，與深靜脈血栓、腦梗死和冠狀動脈硬化性心臟病等多種血栓性疾病發生密切相關[11-12]。本研究中，與健康人相比，anti-β2GPⅠ陽性的血栓患者血小板NOD2受體mRNA表達、血漿IL-1β水平升高，提示血小板炎性反應可能參與anti-β2GPⅠ誘導的血栓形成。

對比入組患者和健康人數據時發現，兩組人群的血清葡萄糖和三酰甘油水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，半數以上患者(57.97%)血清葡萄糖水平超過正常參考范圍卻沒有明確的糖尿病史或現病史，分析后發現多數患者為非空腹采血。為了進一步排除潛在危險因素及血栓形成過程對血小板的干擾作用，本研究利用β2GPⅠ抗原抗體復合物對健康人血小板進行體外刺激[13]。與臨床分析結果相似，β2GPⅠ抗原抗體復合物刺激后血小板NOD2受體mRNA表達、上清液IL-1β水平升高，證實anti-β2GPⅠ可以促使血小板發生炎性反應。

從機制上來講，NOD2受體活化需有跨膜受體進行信號傳遞。研究表明，TLR4和NOD2受體在調節巨噬細胞信號轉導和炎癥因子釋放過程中具有協同作用[14]。然而，另有研究發現，單核細胞NOD2受體能夠調節p62蛋白表達，通過誘導MyD88聚集、下調MyD88-TRAF復合物形成，抑制TLR4信號瀑布調節的炎癥因子產生[15-16]。這提示NOD2受體與TLR4可能存在正/負反饋作用，在不同細胞系或不同刺激劑誘導下，二者相互作用不同。前期研究表明，anti-β2GPⅠ可激活血小板TLR4，促使血小板活化，發揮凝血功能[13]。本研究發現抑制TLR4可部分降低anti-β2GPⅠ誘導的NOD2受體表達，提示TLR4和NOD2受體在anti-β2GPⅠ誘導的炎癥因子釋放過程中起到協同作用，NOD2受體受TLR4調控。

姜科姜黃屬植物根莖提取物姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性[17]。研究表明，姜黃素可降低腫瘤壞死因子-α和IL-6等促炎因子表達[18]。姜黃素還可通過MAPK和核因子(NF)-κB途徑抑制內皮細胞、單核細胞和中性粒細胞活化，減少黏附分子和趨化因子的表達，抑制炎性反應[19]。本研究中，姜黃素可通過抑制血小板NOD2受體活化，進而下調p38 MAPK磷酸化水平，導致IL-1β分泌減少；向注射了anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ的小鼠體內注入姜黃素，可顯著延長FeCl3刺激后血管內血栓形成時間。這表明姜黃素可以通過調控NOD2受體減輕血小板炎性反應，進而減緩anti-β2GPⅠ誘導的血栓形成。

anti-β2GPⅠ可通過NOD2受體/p38 MAPK信號軸調控IL-1β釋放，TLR4在其中起到一定的調控作用。姜黃素可通過抑制NOD2受體，降低p38 MAPK磷酸化及IL-1β水平，減緩anti-β2GPⅠ誘導的血小板炎性反應和血栓形成。本研究結果有望為anti-β2GPⅠ陽性血栓患者治療提供新思路。