miR-139-5p靶基因參與調(diào)控人骨肉瘤細胞表型的機制分析*

魏代平，李海龍，顏春魯△，汪永鋒，呂棟輝，張金龍，李嘉進

1.甘肅省蘭州市皋蘭縣人民醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730299；2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅蘭州 730000

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的侵襲性惡性骨腫瘤，其發(fā)病率和病死率在原發(fā)性骨腫瘤中均居首位。約60%的病例是10～20歲的兒童和青少年。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在骨肉瘤中異常表達，參與了骨肉瘤細胞多種惡性表型的生物學過程，有可能成為骨肉瘤診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后判斷的重要標志物[1]。

有研究報道，骨肉瘤組織中miR-139-5p的表達下調(diào)。miR-139-5p通過靶向調(diào)控SLITRK4[2]、NOTCH1[3]、GPR56[4]、Rock1[5]、RUNX2[6]、DNMT1[7]、CDK14[8]等基因，抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，普遍的研究思路是探討miRNA在腫瘤組織中的功能和對表型的影響，需在生物信息學預(yù)測的基礎(chǔ)上，進行實驗驗證研究。然而，這種預(yù)測存在著一定程度的偶然性和盲目性。本文借助于生物信息學方法，對miR-139-5p的靶基因進行預(yù)測，并對靶基因進行信號通路富集分析，再選擇與腫瘤有關(guān)的信號通路中的基因進行蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，而后篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的參數(shù)，選擇Cytoscape3.8軟件構(gòu)建關(guān)鍵核心基因；對關(guān)鍵核心基因使用HCMDB數(shù)據(jù)庫，分析其在骨肉瘤中的表達，從而解析miR-139-5p的靶基因及其調(diào)控惡性表型的分子機制，為骨肉瘤分子標志物研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 從dbDEMC(https://www.biosino.org/dbDEMC/)數(shù)據(jù)庫檢索到GEO(GSE28423)數(shù)據(jù)集,包含19個骨肉瘤細胞系及4個正常對照細胞的miRNA表達譜，從中檢索miR-139-5p的表達。從HCMDB數(shù)據(jù)庫(http://hcmdb.i-sanger.com/index)檢索到44例GEO(GSE14359和GSE32981)數(shù)據(jù)集中骨肉瘤組織和正常組織表達，用于驗證miR-139-5p的關(guān)鍵核心基因的差異表達。

1.2方法

1.2.1miR-139-5p在骨肉瘤細胞中的表達 使用dbDEMC數(shù)據(jù)庫檢索miR-139-5p在骨肉瘤細胞中相對于正常對照細胞的差異表達。

1.2.2miR-139-5p靶基因預(yù)測和靶基因富集信號通路分析 使用miRSystem網(wǎng)站(http://mirsystem.cgm.ntu.edu.tw/index.php)中集成的DIANA、MIRANDA、MIRBRIDGE、PICTAR、PITA、RNA22、TARGETSCAN軟件對miR-139-5p的靶基因進行預(yù)測和分析，選取至少3個軟件支持的靶基因作為下一步分析的候選基因，對所檢索到的靶基因使用DAVID6.8(https://david.ncifcrf.gov/)軟件進行KEGG信號通路富集分析，富集聚類分析采用Fisher確切概率法，檢驗水準為α<0.05。

1.2.3miR-139-5p靶基因的腫瘤相關(guān)信號通路PPI網(wǎng)絡(luò)分析 選擇在線軟件string(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，將72個miR-139-5p靶基因中與腫瘤信號通路具有相關(guān)性的基因輸入在線軟件string進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，觀察節(jié)點，分析其節(jié)點后，對節(jié)點和周邊數(shù)據(jù)進行提取并導(dǎo)出文件。

1.2.4選擇miR-139-5p的腫瘤相關(guān)信號通路基因進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因分析 將PPI數(shù)據(jù)庫構(gòu)建作用靶點輸入Cytoscape3.8軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，采用其插件MCODE計算參數(shù)，篩選關(guān)鍵基因。

1.2.5腫瘤密切相關(guān)通路基因的表達情況分析 選擇前述的關(guān)鍵基因，檢索HCMDB數(shù)據(jù)庫，利用在線軟件檢索分析這些關(guān)鍵基因在骨肉瘤組織中的表達。

2 結(jié) 果

2.1miR-139-5p在骨肉瘤細胞中的表達 使用dbDEMC數(shù)據(jù)庫檢索了miR-139-5p在骨肉瘤細胞中相對于正常對照細胞的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-139-5p在骨肉瘤細胞中明顯表達下調(diào)(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-139-5p在骨肉瘤細胞中的表達

2.2miR-139-5p靶基因預(yù)測 使用miRSystem網(wǎng)站的生物信息學數(shù)據(jù)庫進行了miR-139-5p的靶基因預(yù)測，以至少3個軟件支持的靶基因作為選擇標準，共獲得407個靶基因。

2.3miR-139-5p靶基因富集信號通路分析 將所獲得的407個靶基因輸入DAVID6.8在線軟件進行信號通路分析，共獲得59條信號通路，其中，有21條信號通路與腫瘤有關(guān)，見表1。這些通路包括mTOR通路、癌癥中的蛋白多糖、小細胞肺癌、cAMP信號通路、細胞外受體相互作用、焦點粘連、膠質(zhì)瘤等。

表1 miR-139-5p靶基因富集信號的21條腫瘤相關(guān)信號通路

2.4miR-139-5p靶基因腫瘤通路PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 有73個基因富集在與腫瘤密切相關(guān)的信號通路中(表1)，將其輸入在線軟件string進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并將其聚類在3個模塊中(圖2)。分析其節(jié)點，Cytoscape3.8軟件的插件MCODE計算參數(shù)，篩選出IGF1R、NOTCH1、CDH1、FOS、FN1、JUN、CDC42、CXCR4、RPS6KB1共9個基因為關(guān)鍵基因。

圖2 Cytoscape軟件的MCODE插件篩選的9個關(guān)鍵核心基因

2.5miR-139-5p靶基因中關(guān)鍵核心基因在骨肉瘤中的表達分析 選擇在線HCMDB數(shù)據(jù)庫，檢索分析9個miR-139-5p的靶基因中的關(guān)鍵核心基因IGF1R、NOTCH1、CDH1、FOS、FN1、JUN、CDC42、CXCR4、RPS6KB1在骨肉瘤中的表達(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOTCH1、FN1、CXCR4、RPS6KB1在正常組織與骨肉瘤組織之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這4個靶基因作為miR-139-5p的預(yù)測靶基因，至少獲得3個軟件支持(表2)。

圖3 關(guān)鍵核心基因在正常組織與骨肉瘤組織之間差異表達(HCMDB數(shù)據(jù)庫)

表2 miR-139-5p的靶基因預(yù)測軟件支持情況

3 討 論

人類miR-139-5p屬于miR-139家族，其成熟體核心堿基序列為“UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU”。有研究指出，miR-139-5p在腫瘤組織中高表達，其表達與肺癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]、卵巢癌[11]、膀胱癌[12]、食管癌[11]、胃癌[13]等多種腫瘤的生物學行為密切相關(guān)。也有實驗研究發(fā)現(xiàn)miR-139-5p明顯影響骨肉瘤細胞的惡性表型，其機制通過負向調(diào)控SLITRK4、NOTCH1、GPR56、Rock1、RUNX2、DNMT1、CDK14實現(xiàn)。復(fù)習文獻，不難發(fā)現(xiàn)，在不同腫瘤中同一miRNA靶向調(diào)控的基因存在差別。因此，開展miRNA的功能及其靶基因的研究，單純依賴生物信息學分析是遠遠不夠的。如何更有效開展miRNA靶基因的驗證研究值得深入探討。必須考慮所探討的靶基因在特定組織中的表達情況，否則，所選擇的靶基因難免存在偶然性和盲目性。

本研究借助于生物信息學數(shù)據(jù)庫，對miR-139-5p的靶基因進行預(yù)測，將所獲得的407個靶基因輸入DAVID6.8在線軟件，進行信號通路富集分析，共獲得59條信號通路，其中，有21條信號通路與腫瘤有關(guān)。這些通路包括mTOR信號通路、癌癥中的蛋白多糖、小細胞肺癌、cAMP信號通路、細胞外受體相互作用、焦點粘連、膠質(zhì)瘤等。對富集在這些通路中的73個基因采用在線軟件string進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。分析其節(jié)點后，將節(jié)點和周邊數(shù)據(jù)提取后導(dǎo)入Cytoscape3.8軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，采用目前通用的插件MCODE計算參數(shù)，篩選出IGF1R、NOTCH1、CDH1、FOS、FN1、JUN、CDC42、CXCR4、RPS6KB1共9個基因為關(guān)鍵基因。

按照基因時間、空間表達的特異性，借助于HCMDB數(shù)據(jù)庫，檢索骨肉瘤癌基因數(shù)據(jù)庫分析后發(fā)現(xiàn)，在miR-139-5p調(diào)控的靶基因中的關(guān)鍵核心基因中，NOTCH1、FN1、CXCR4、RPS6KB1是在骨肉瘤中表達上調(diào)的癌基因，其他5個基因并非癌基因。其中NOTCH1作為miR-139-5p的靶基因，在骨肉瘤細胞中已經(jīng)得到實驗驗證[3]。FN1、CXCR4、RPS6KB1較少見文獻報道，可作為未來進一步深入探討的靶基因。NOTCH1作為NOTCH信號通路的分子[14]，可作為膜結(jié)合配體Jagged1、Jagged2和Delta1的受體來調(diào)節(jié)細胞的活性。NOTCH1與配體結(jié)合以后釋放其細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)，然后轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)與RBPJ/RBPSUH形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，并激活分裂位點增強子的基因，從而影響分化、增殖和凋亡程序的執(zhí)行，NOTCH也是人類腫瘤中開展靶向治療的重要靶點[15]。FN1是TNFSF12/TWEAK的受體，為某些細胞的弱凋亡誘導(dǎo)劑，可促進血管生成和內(nèi)皮細胞增殖[16]，可能調(diào)節(jié)細胞與基質(zhì)蛋白的黏附。CXCR4是CXC趨化因子CXCL12/SDF-1的受體，通過增加細胞內(nèi)鈣離子水平和促進MAPK1/MAPK3激活來傳遞信號[17]。作為細胞外泛素的受體，CXCR4可增加細胞內(nèi)鈣離子水平和降低細胞cAMP水平。RPS6KB1是mTOR信號通路的下游效應(yīng)分子[18]，在蛋白質(zhì)合成、細胞增殖、細胞生長、細胞周期進程和細胞存活的調(diào)節(jié)中整合生長因子信號。原發(fā)性肝癌患者中出現(xiàn)RPS6KB1高表達，往往提示預(yù)后不良[19]。因此，NOTCH1、FN1、CXCR4、RPS6KB1是miR-139-5p靶基因中的關(guān)鍵核心基因，對其進行研究，將是揭示miR-139-5p參與人骨肉瘤細胞表型的重要突破口。

本文解析了miR-139-5p的靶基因及其調(diào)控惡性表型的分子機制，為骨肉瘤分子標志物研究提供依據(jù)。此外，本文所建立的方法對于同類研究有一定的啟示作用。