Ras鳥苷酸釋放蛋白1、垂體同源框1、消皮素D在皮膚黑色素瘤中的表達及相關性研究*

徐 妍，張曉莉，孫 屏，陳許蕾，陳暑波，杭 猛，徐 偉△

南京醫科大學附屬無錫第二醫院：1.腫瘤科；2.皮膚科；3.病理科，江蘇無錫 214000

皮膚黑色素瘤是一種皮膚黑色素細胞來源的高度惡性腫瘤，其多發于足跖、手指、下肢、會陰部和腳指甲下等部位，發展迅速、預后差、病死率較高[1]。皮膚黑色素瘤患者早期可出現淋巴結、肝、肺、腦等轉移，后期治療較棘手。其中侵襲、轉移是導致患者死亡的主要原因[2]。Ras鳥苷酸釋放蛋白1(RASGRP1)在乳腺癌中陽性表達降低，且對乳腺癌細胞增殖、遷移具有一定影響；垂體同源框1(PITX1)在肺腺癌組織中的水平變化與患者的TNM分期、淋巴結轉移情況和腫瘤大小顯著相關；消皮素D(GSDMD)表達與上皮性卵巢癌患者淋巴結轉移及不良預后發生密切相關，為不良預后的獨立危險因素[3-5]。既往研究顯示，GSDMD低表達是上皮性卵巢癌患者不良預后發生的獨立危險因素[3-5]。目前臨床上關于RASGRP1、PITX1、GSDMD三者聯合檢測在皮膚黑色素瘤中的報道較少，故本文進行了相關研究，旨在探討以上指標在皮膚黑色素瘤中的表達及相關性，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2019年12月于本院就診的72例皮膚黑色素瘤患者納入研究組，包括男38例、女34例，年齡30～78歲、平均(56.84±20.23)歲。其中有淋巴結轉移31例,無淋巴結轉移41例；浸潤程度：ClarkⅠ～Ⅱ期(淺浸潤)44例，ClarkⅢ～Ⅴ期(深浸潤)28例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ期18例，Ⅳ期10例。選取同期在本院進行整形手術的皮膚正常者40例為對照組。按照美國癌癥分期聯合會制定的第7版TNM分期系統對皮膚黑色素瘤病理結果進行分期[6]。所有研究對象及家屬均知情同意本研究，且本研究符合《赫爾辛基宣言》倫理學要求。

納入標準：研究組患者符合《中國黑色素瘤規范化病理診斷專家共識(2017年版)》[7]中皮膚黑色素瘤診斷標準；所有患者術前未進行放化療及靶向治療；病歷資料完整；所有標本均經病理科組織病理學確診；預計壽命超過3個月。對照組所取標本經病理組織學確診為良性痣，無惡變。排除標準：嚴重營養不良、患有精神疾病或合并惡性腫瘤者；心、肝、肺、腎等臟器嚴重疾病者；妊娠期或哺乳期女性。

1.2方法

1.2.1標本采集 取研究組患者6 μm厚度癌組織、癌旁組織標本以及對照組良性痣組織進行固定、石蠟包埋、連續切片處理，脫蠟、水化后清洗3次，3分鐘/次，之后使用95 ℃枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)加熱，30 min后取出冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗。滴加0.3%過氧化氫阻斷劑、4%脫脂奶粉，恒溫孵育30 min，添加一抗CD63蛋白的兔單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，滴加二抗GB，再次孵育30 min，再與抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物孵育30 min，使用PBS清洗，3,3-二氨基聯苯胺(DAB)溶液顯色處理8 min，蘇木精染核，反藍、脫水處理后封片。

1.2.2免疫組化法檢測 將準備好的切片放置60 ℃烤箱，烤片2 h，使用二甲苯反復脫蠟3次，10分鐘/次，梯度乙醇水化，用蒸餾水沖洗5 min。將切片放置于塑料染色架上，放入0.01 mol/L pH 6.0枸櫞酸組織抗原緩沖液中，加熱15～20 min，冷卻。蒸餾水沖玻片洗2次，PBS沖洗3次，3分鐘/次。組織切片滴加過氧化物酶阻斷劑，恒溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。去除PBS，滴加1滴一抗，放入4 冰箱保存；次日取出放置30 min，PBS沖洗3次，3分鐘/次。除去PBS，切片滴加50 μL MaxVisionTM試劑，恒溫孵育15 min，PBS沖洗3次，3分鐘/次。除去PBS，切片滴加DAB顯色試劑顯色。3～5 min后沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核1 min，沖洗、反藍。梯度乙醇脫水，二甲苯透明10 min，風干，封片。

1.2.3反轉錄PCR(RT-PCR)檢測RASGRP1、PITX1、GSDMD表達 提取細胞總RNA并對純度、水平進行檢測，反轉錄處理，反應條件：預變性95 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s；72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃終末延伸6 min，Ct值(2-ΔΔCt)法表示RASGRP1、PITX1、GSDMD相對表達量。各引物序列：RASGRP上游引物5′-TCCTTCTGTGTGATGGACAAAGAC-3′，RASGRP下游引物5′-CTGTGGGAGCTACTGGGTTCTT-3′；PITX1上游引物5′-GGCTACTCCTACAACAACTGGG-3′，PITX1下游引物5′-AACATGGACTGCGACGACA-3′；GSDMD上游引物5′-GGACCCTAACACCTGGCAGACT-3′，GSDMD下游引物5′-TTGTGGGTGCGCGTGA CTT-3′；內參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′。

1.2.4隨訪 對研究組研究對象進行1年隨訪，通過住院復查、電話詢問等方式獲得患者客觀生存情況及皮膚黑色素瘤切除后有無復發、增大。入選病例隨訪至病例死亡或截至2020年12月。隨訪結束后，根據研究組患者死亡情況評估預后情況，其中預后良好(非死亡)39例、預后不良(死亡)33例。

2 結 果

2.1RASGRP1、PITX1、GSDMD在不同組織中的表達 如表1所示，與對照組相比，研究組癌組織及癌旁組織中RASGRP1、PITX1表達降低，GSDMD表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與癌旁組織相比，癌組織中RASGRP1、PITX1表達降低，GSDMD表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 RASGRP1、PITX1、GSDMD在不同組織中的表達

2.2RASGRP1、PITX1、GSDMD與皮膚黑色素瘤患者病理特征的相關性分析 如表2所示，RASGRP1、PITX1、GSDMD的表達與皮膚黑色素瘤患者性別、年齡無關(P>0.05)，與腫瘤最大徑、浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、其他部位轉移、預后情況、臨床分期有關(P<0.05)，且腫瘤最大徑≥2 cm、ClarkⅢ～Ⅴ期、低分化、淋巴結轉移、其他部位轉移、預后不良、Ⅳ期皮膚黑色素瘤患者RASGRP1、PITX1表達較低，GSDMD表達較高(P<0.05)。

表2 RASGRP1、PITX1、GSDMD與皮膚黑色素瘤患者病理特征的相關性分析

表2 RASGRP1、PITX1、GSDMD與皮膚黑色素瘤患者病理特征的相關性分析

2.3RASGRP1、PITX1、GSDMD之間的相關性分析 如圖1所示，Pearson相關分析結果顯示，RASGRP1與PITX1呈正相關(r=0.523，P=0.001)，RASGRP1與GSDMD呈負相關(r=-0.612，P=0.001)，PITX1與GSDMD呈負相關(r=-0.569，P=0.001)。

注：A為RASGRP1與PITX1的相關性；B為RASGRP1與GSDMD的相關性；C為PITX1與GSDMD相關性。

2.4RASGRP1、PITX1、GSDMD單項及聯合檢測對皮膚黑色素瘤的診斷價值 如表3、圖2所示，RASGRP1、PITX1、GSDMD聯合檢測對皮膚黑色素瘤的診斷價值優于單項檢測，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 RASGRP1、PITX1、GSDMD單項及聯合檢測對皮膚黑色素瘤的診斷價值

3 討 論

臨床研究顯示，MAPK/ERK信號通路在黑色素瘤的發生、發展中起著重要作用，可通過遺傳和表觀遺傳事件重新激活MAPK信號，是腫瘤獲得靶向治療耐藥性的主要機制。RASGRP1是Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子的重要成員之一，可通過將T細胞受體與Ras-促絲裂原-激活的蛋白激酶信號通路偶聯，調控細胞的增殖和存活，將GDP交換為GTP進而促進Ras活化，進一步活化RAF1-MEK1/2-ERK1/2途徑[7-9]。RASGRP1與Ras信號通路蛋白在大腸癌、非小細胞肺癌中表達異常，可作為藥物抗癌的重要靶點。RASGRP1通過參與細胞新陳代謝及清除損傷基因的外源性化合物，抑制和緩解DNA損傷和癌變，可為研究腫瘤發生、發展機制提供重要線索[10]。本研究中皮膚黑色素瘤組織中RASGRP1表達低于良性痣組織、癌旁組織，說明RASGRP1在皮膚黑色素瘤中呈低表達，且隨著腫瘤最大徑增大、浸潤程度加深、分化程度加劇、淋巴結轉移、其他部位轉移、預后不良、臨床分期加劇，其表達逐漸降低。其原因可能是RASGRP1為Ras的促凋亡作用因子，可通過調控Ras蛋白信號轉導、T細胞受體信號通路影響皮膚黑色素瘤的發生、發展。

PITX1屬于抑癌基因，可通過直接結合啟動子進而抑制端粒酶發揮作用，研究顯示，PITX1在人黑色素瘤細胞株中呈低表達，是人類皮膚腫瘤的預后指標[11]。PITX1是同源盒基因家族主要成員之一，在人體組織以及腫瘤的發生、發展中起關鍵作用。有研究發現，PITX1在非小細胞肺癌組織中表達水平明顯升高，且高于正常組織[12]；PITX1在胃癌組織中呈低表達且與胃癌患者不良預后密切相關[13]，但關于PITX1在皮膚黑色素瘤中報道較少。既往研究顯示，PITX1在人子宮頸鱗狀細胞癌、胃癌、子宮內膜癌中表達異常，可作為新興的生物標志物，并且可作為人子宮頸鱗狀細胞癌化學藥物治療敏感性的生物標志物[14]。在本研究中，PITX1在黑色素瘤組織中表達明顯低于癌旁組織，且隨著腫瘤最大徑增大、浸潤程度加深、分化程度加劇、淋巴結轉移、其他部位轉移、預后不良、臨床分期加劇，其表達逐漸降低。其原因可能為PITX1可通過RASAL1影響RAS途徑，抑制致瘤性發展。RASAL1是RAS-GAP基因家族成員(控制Ras蛋白活性的是GTP酶激活蛋白)，抑制RAS/MAKP途徑的激活有助于抑制人黑色素瘤細胞的增殖。

GSDMD是Gsdermin家族主要成員之一，是細胞凋亡過程中的效應蛋白，在食管鱗癌中，高表達GSDMD可介導并激活半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)依賴的細胞凋亡，導致食管鱗癌患者病情進展受到抑制，可作為放化療替代治療手段[15]。有研究顯示，GSDMD表達與上皮性卵巢癌患者淋巴結轉移及患者不良預后密切相關，為不良預后的獨立危險因素；GSDMD是細胞凋亡的關鍵蛋白酶，是細胞凋亡過程中炎性半胱氨酸蛋白酶的共同效應蛋白，受炎性半胱氨酸蛋白酶刺激，釋放一些炎癥因子,進而激活T細胞介導的抗腫瘤免疫反應[16-18]。在本研究中，GSDMD在黑色素瘤組織中表達明顯高于癌旁組織、良性痣組織，提示其在皮膚黑色素瘤中呈高表達。GSDMD隨著腫瘤最大徑增大、浸潤程度加深、分化程度加劇、淋巴結轉移、其他部位轉移、預后不良、臨床分期加劇，其表達增加。其原因可能為高表達GSDMD可能與其誘導細胞凋亡的能力減弱有關。

綜上所述，本研究結果顯示，RASGRP1、PITX1在皮膚黑色素瘤中低表達，GSDMD在皮膚黑色素瘤中高表達。RASGRP1、PITX1、GSDMD兩兩之間呈線性相關且與病理特征有著明顯關聯，隨著腫瘤最大徑增大、浸潤程度加深、分化程度加劇、淋巴結轉移、其他部位轉移、預后不良、臨床分期加劇，RASGRP1、PITX1表達越低，GSDMD表達越高。此外，本研究存在樣本量小、病例來源局限等不足，研究結果仍需大樣本、多中心試驗驗證。