T2DM合并NAFLD老年患者血清miR-34a的表達水平與肝脂肪含量及胰島素抵抗的關系*

鄧文娟，谷 君，張志英，董運成，賈文文

河北北方學院附屬第一醫院內分泌科,河北張家口 075000

2型糖尿病(T2DM)是因胰島素抵抗(IR)或胰島素分泌不足而引起的一類疾病，為糖尿病的常見類型。近年來T2DM患病率逐漸提升，導致相關醫療費用支出和死亡人數日益增加，嚴重影響全球人口預期壽命[1]。非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種與IR和遺傳易感性密切相關的代謝應激性肝損傷[2]，與T2DM存在明顯關聯，數據顯示，40%～50%的NAFLD患者伴有糖代謝異常，50%～70%的T2DM患者可伴有血脂代謝異常或NAFLD[3]。有報道顯示，合并NAFLD的T2DM患者脂代謝紊亂及IR更為嚴重，可增加重度脂肪肝、肝纖維化甚至肝癌的發生率，嚴重威脅患者生命安全[4]。因此，積極探討T2DM患者NAFLD發生的影響因素具有重要意義。微小核糖核酸(miRNA)是一類內源性非編碼小RNA，可調控細胞的多種生物學功能，研究表明，miRNA在T2DM與NAFLD的發生、發展過程中扮演重要角色[5]。miR-34a是一種miRNA，已有報道分別顯示，其參與了T2DM[6]和NAFLD[7]發病，但關于其在T2DM合并NAFLD中的作用較少有研究報道。本研究主要探討T2DM合并NAFLD患者血清miR-34a的表達水平與肝脂肪含量(LFC)及IR的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2018年7月至2020年7月收治的118例T2DM患者，其中男88例，女30例；年齡42～76歲，平均(58.69±6.44)歲；體質量指數(BMI)18～30 kg/m2，中位BMI 23 kg/m2。根據是否合并NAFLD分為T2DM組(66例)和NAFLD組(52例)。納入標準：(1)T2DM符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[8]中的診斷標準；NAFLD符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018更新版)》[9]中的診斷標準，LFC>9.15%；(3)臨床資料完整；(5)近期無感染。排除標準：(1)除T2DM外的其他類型糖尿病患者；(2)肝硬化、酒精性肝病、藥物性肝損害、病毒性肝炎、肝癌等其他肝臟疾病者；(3)有氨甲蝶呤、胺碘酮、雌激素、類固醇等藥物使用史者；(4)既往使用過對鈣、磷、維生素D代謝有影響藥物者；(5)男、女性飲酒折合乙醇量≥30、≥20 g/d者；(6)嚴重心、肺、肝、腎功能不全者。本研究經本院倫理委員會批準，患者及家屬均知情研究。

1.2方法

1.2.1一般資料收集 收集所有患者一般資料，包括性別、年齡、BMI[體重(kg)/身高(m2)]、腰臀比(WHR,腰圍/臀圍)、血壓[收縮壓(SPB)、舒張壓(DPB)]。

1.2.2相關生化指標檢測 采集患者入院后次日清晨5 mL空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用邁瑞BS-200全自動生化分析儀測定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平，采用HOMA穩態模型計算胰島素抵抗指數[HOMA-IR，FINS(mIU/L)×FPG(mmol/L)/22.5]。

1.2.3血清miR-34a表達水平測定 采用Trizol試劑盒(廣州華劍生物科技有限公司)提取血清總RNA，TakaRa反轉錄試劑盒(廣州泛思生物科技有限公司)轉錄合成cDNA，加入miR-34a引物序列(上游：5′-CCCACATTTCCTTCTTATCAACAG-3′；下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)。采用實時熒光定量PCR法進行檢測，反應條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 10 s、63 ℃、72 ℃，循環40次。以U6(上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′；下游：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′)作為內參進行校正，2-ΔΔCt法計算血清miR-34a相對表達水平。

1.2.4LFC測量方法 所有患者入院后均使用GE LOGIQ E 超聲診斷儀進行肝臟超聲脂肪定量檢查，利用NIH圖像分析軟件測量肝腎感興趣區灰階值、標準化肝腎回聲比值，根據XIA等[10]改進的計算公式計算LFC。

2 結 果

2.1兩組患者一般資料對比 NAFLD組BMI、TG、LDL-C、AST、ALT、FINS、HbA1c、HOMA-IR、LFC明顯高于T2DM組(P<0.05)；兩組患者性別、年齡等資料對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料對比

2.2兩組患者血清miR-34a相對表達水平對比 NAFLD組血清miR-34a相對表達水平[2.04(1.54,2.54)]明顯高于T2DM組[1.50(1.35,1.71)]，差異有統計學意義(Z=-4.711，P<0.05)。

2.3NAFLD組患者血清miR-34a相對表達水平與LFC和HOMA-IR的相關性 Spearman相關分析顯示，NAFLD組患者血清miR-34a相對表達水平與LFC、HOMA-IR呈正相關(r=0.741、0.591，P<0.05)。見圖1。

注：A、B分別為miR-34a相對表達水平與LFC、HOMA-IR相關性的散點圖。

2.4T2DM患者合并NAFLD影響因素的多因素Logistic回歸分析 以BMI、TG、LDL-C、AST、ALT、FNS、HbA1c、HOMA-IR、LFC、miR-34a為自變量，是否合并NAFLD(是=1，否=0)為因變量，多因素Logistic回歸分析結果顯示，BMI、ALT、FINS、HOMA-IR、LFC、miR-34a為T2DM合并NAFLD的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 T2DM合并NAFLD影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

國際糖尿病聯盟報道顯示，2019年全球約有4.63億糖尿病患者，預計到2045年將達7.002億[11]。我國為亞洲糖尿病患病人數最多的國家，截至2019年，我國糖尿病患病人數為1.22億，給個人、家庭乃至國家帶來了沉重負擔。NAFLD是一種慢性肝臟疾病，IR為T2DM與NAFLD共同的危險因素，隨著近年來T2DM患病率的增加，NAFLD患病率也逐年上升。目前脂肪性肝病已成為我國僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[12]，因此早期干預對控制NAFLD發生、發展具有重要意義。

NAFLD主要特征為肝臟脂肪積聚和IR，與肥胖、糖脂代謝紊亂等有關，當肝內脂肪沉積過多時，可出現肝被膜膨脹、肝韌帶牽拉等變化。本研究結果顯示，NAFLD組BMI、TG、LDL-C、AST、ALT、FINS、HbA1c、HOMA-IR、LFC均明顯高于T2DM組(P<0.05)，符合NAFLD的表現。miRNA是近年來新發現的一種內源性非編碼小RNA，長度僅為20 bq左右，可通過互補配對mRNA堿基序列，結合靶mRNA的3′-非翻譯區，抑制靶mRNA轉錄后翻譯。目前研究證實，miRNA參與了細胞多種生物學過程，與糖尿病、肝臟疾病等有關[5]。miR-34基因家族包括miR-34a/b/c，其中miR-34a基因定位于1p36.23，受啟動子區域CpG島甲基化、p53基因、染色體等因素調節，同時也能通過調控多種靶基因參與細胞增殖、凋亡、分化等過程[13]。有報道顯示，miR-34a為游離脂肪酸介導的胰島β細胞功能受損機制中重要的調控基因，miR-34a高表達可損傷胰島β細胞功能，影響胰島素分泌，而胰島素分泌異常為T2DM與NAFLD共同的危險因素，由此提示miR-34a可能參與了二者的發生[14]。TG沉積為NAFLD形成和發展必要條件，肝臟中脂肪分解主要在線粒體進行，因此肝臟內線粒體數目減少會引起TG沉積和脂肪變性，促進NAFLD發生[15]。研究顯示，miR-34a過度表達會降低肝臟線粒體含量，升高TG水平，損害線粒體功能[16]，進一步說明miR-34a參與NAFLD的發生。本研究結果顯示，NAFLD組血清miR-34a相對表達水平明顯高于T2DM組，與LFC、HOMA-IR呈正相關(P<0.05)，符合上述報道結果。本研究Logistic回歸分析結果提示，miR-34a為T2DM合并NAFLD的獨立危險因素(P<0.05)，說明miR-34a參與了NAFLD發生，但尚不明確其作用機制。

成纖維細胞生長因子-21(FGF-21)主要由脂肪組織和肝臟產生，可通過分泌入血調節機體內代謝過程，包括維生素代謝、糖脂代謝及膽汁酸和膽固醇合成，與T2DM和NAFLD發生密切相關[17]。研究顯示，miR-34a可抑制肥胖小鼠FGF-21信號傳遞，引起代謝異常[18]，提示miR-34a可能通過抑制FGF-21參與膽汁酸和膽固醇合成、糖脂代謝等過程，促進NAFLD發生。T2DM與NAFLD的共同病理特征除了IR外，還與肝毒性細胞因子上調、氧化應激反應、慢性炎癥等有關。沉默信息調節因子1(SIRT1)具有調節IR和抗氧化應激作用[19]。黃焱等[20]研究顯示，miR-34a可通過靶向SIRT1，促進高糖代謝記憶發展，為糖尿病及其慢性并發癥的高危因素。KARIMI-SALES等[21]研究顯示，miR-34a能結合SIRT1的3′-非翻譯區負向調控SIRT1表達，促進肝臟炎癥發展和降低肝臟對胰島素的敏感性。基于此，筆者推測，T2DM患者miR-34a高表達可能通過負向調控FGF-21、SIRT1表達促進NAFLD發生，可能作為T2DM合并NAFLD的一個新干預靶點。

綜上所述，T2DM合并NAFLD患者血清miR-34a相對表達水平明顯上調，與LFC和HOMA-IR密切相關，為合并NAFLD的獨立危險因素，可能作為T2DM合并NAFLD的一個新干預靶點。但本研究為單中心研究，還需擴大樣本量，進一步證實miR-34a與T2DM合并NAFLD的關系，并進一步探討其作用機制。