貽貝粗多糖對環磷酰胺致小鼠免疫低下及生殖遺傳毒性的保護作用

何嘉桃 蘇澤椿 孫東方 黃達榮 王倩文 陳影聰 孫力軍

摘要 [目的] 研究貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠的免疫功能、生殖能力和遺傳穩定性的作用效果。[方法] 采用環磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，同時灌胃木瓜蛋白酶提取的貽貝多糖進行干預，7 d后測定體重、器官指數、血常規、骨髓細胞微核率、精子致畸率。[結果] 與對照組相比，在第7天模型組小鼠的體重顯著下降，胸腺指數明顯降低34.6%，腸指數、心臟指數分別顯著升高73.4%、43.6%，小鼠的白細胞、紅細胞、血小板、紅細胞平均體積、紅細胞壓積下降，淋巴細胞、中間細胞、中性粒細胞的百分比失衡，微核率和精子畸變率分別提高了17.67千分點和7.77百分點。與模型組相比，低、高劑量組在以上指標均有不同程度的改善。[結論] 一定劑量的貽貝粗多糖能改善環磷酰胺誘導免疫抑制小鼠的免疫功能，緩解環磷酰胺導致的遺傳毒性和生殖毒性。

關鍵詞 貽貝粗多糖;環磷酰胺;免疫抑制;生殖遺傳毒性

中圖分類號 TS 201.4? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）03-0170-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.046

Protective Effects of Mussel Crude Polysaccharides on Immunodeficiency and Reproductive Genotoxicity Induced by Cyclophosphamide in Mice

HE Jia-tao，SU Ze-chun，SUN Dong-fang et al

（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract [Objective]To study the effect of immunosuppression，reproductive ability and genetic stability of mussel crude polysaccharides on cyclophosphamide-induced immunosuppression in mice.[Method]Mice were given cyclophosphamide intragastrically to establish immunosuppressive mice model，while polysaccharide from common mussel were extracted by papain was fed with mice by intragastric administration.After 7 days，effects of mussel crude polysaccharides of immunocompromised mice was studied by detecting many indices，such as body weight，organ indices，blood routine index，bone marrow cell micronucleus rate and sperm aberration rate.[Result] Compared with control group，the model group mice significantly reduced the body weight，significantly decreased the thymus index level by 34.6% ，significantly increased cardiac index，the index of intestinal level by 73.4%，43.6%，respectively.The leucocytes，erythrocyte，hemoglobin，platelet，mean corpuscular volume and hematocrit of model group mice were significantly lower than those of control group.The model group mice of the percentage of lymphocytes，intermediate cells and neutrophils was inbalance，the micronucleus rate and sperm aberration rate increased by 17.67 thousandth point， 7.77 percentage point and compared to the control group.Compared with model group，low and high dose groups had different degree of improvement in the above indexes.[Conclusion] A certain dose of mussel crude polysaccharide can improve the immune function of immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide，and alleviate the genetic and reproductive toxicity caused by cyclophosphamide.

Key words Mussel crude polysaccharides;Cyclophosphamide;Immunosuppression;Reproductive toxicity and genotoxicity

基金項目 國家級大學生創新創業訓練計劃項目（CXXL2018007）;廣東省科技廳公益研究與能力建設專項資金項目（2014B020204005）。

作者簡介 何嘉桃（1998—），女，廣東佛山人，碩士研究生，研究方向：水產品質量安全與營養功能。通信作者，教授，博士，博士生導師，從事水產品質量安全與營養功能研究。

收稿日期 2021-04-23

環磷酰胺廣譜抑制癌細胞生長[1]，且價格低廉、效果顯著，已廣泛應用于臨床治療[2]。但研究發現，服用環磷酰胺會引起一系列副作用，如抑制免疫細胞增殖和免疫器官的正常發育[3]，降低機體的免疫能力;誘導器官組織氧化應激損傷[4];遺傳物質發生改變，機體內生殖細胞發生突變[5]。多糖是常用的免疫調節劑[6]。但目前的研究主要集中在植物多糖對免疫低下小鼠免疫功能的影響，海洋源多糖類的相關研究相對缺乏。

貽貝屬雙殼軟體動物是我國東部沿海地區貝類養殖業中的重要種類[7]。貽貝產量高，富含營養物質，經相關研究表明，貽貝中的活性多糖具有調節免疫[8]、降血脂[9]、抗氧化[10]等作用，但普遍應用效率低下。

評定機體免疫力強弱的指標主要有免疫器官指數、白介素的含量、免疫球蛋白的含量、NK細胞殺傷活性、淋巴細胞活性、血常規等。根據目前已有研究，貽貝多糖對正常小鼠、致敏小鼠具有免疫增強作用[8]，通過測定NK細胞殺傷活性、白介素的含量等指標，確定貽貝粗多糖具有提高環磷酰胺誘導免疫低下小鼠免疫力[11]的作用。但有關于從免疫細胞的組成和數目（血常規指標）等觀察貽貝粗多糖的免疫效果以及貽貝粗多糖對生殖遺傳毒性作用的相關研究較少。因此，該研究利用貽貝粗多糖灌胃小鼠，對比體重、器官指數、血常規指標、骨髓細胞微核率及精子致畸率的變化，探討貽貝粗多糖對免疫低下小鼠免疫細胞含量、組成變化及緩解環磷酰胺對機體的生殖遺傳毒效應，有助于開發化療患者治療過程中配套服用的貽貝多糖保健品，降低環磷酰胺對機體產生的毒副作用，實現貽貝的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

貽貝（湛江海鮮市場）;環磷酰胺（深圳安泰生物科技有限公司）;木瓜蛋白酶（上海瑞永生物科技有限公司）;HC2200 型血常規分析儀（中國蘇州邁瑞公司）; CKX41型光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 貽貝粗多糖的制備和測定。

去殼取貽貝肉，勻漿，冷凍干燥，磨制成粉。用索氏提取法對貽貝粉進行脫脂，得去脂貽貝粉，備用。將去脂貽貝粉過20目篩，按料液比（g∶mL）1∶15配制成溶液，調節溫度為60 ℃，pH為7，加入1%木瓜蛋白酶，酶解，升溫到99 ℃滅酶20 min。調pH為中性，4 000 r/min離心5 min，取上清，Sevage法除蛋白，濃縮液體，按體積比4∶1（乙醇∶濃縮液）加入95%乙醇醇沉，4 ℃靜置12 h，離心，把沉淀冷凍干燥后可得貽貝粗多糖。利用硫酸-苯酚法測定酶解后的含糖量。

1.2.2 實驗動物及分組。

15只SPF級別7周齡昆明雄性小鼠，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，在溫度（24±2） ℃、濕度（60±10）%的條件下，適應性喂養7 d，隨機平均分為5組，每組3只，分為對照組、模型組、貽貝粗多糖組、低劑量試驗組、高劑量試驗組。

①對照組[蒸餾水，20 mL/（d·kg）];②模型組[環磷酰胺10 mL/（d·kg）+蒸餾水10 mL/（d·kg）];③貽貝粗多糖組[5.0 mg/mL貽貝粗多糖20 mL/（d·kg）];④低劑量試驗組[環磷酰胺10 mL/（d·kg）+2.5 mg/mL貽貝粗多糖10 mL/（d·kg）];⑤高劑量試驗組[環磷酰胺10 mL/（d·kg）+10.0 mg/mL貽貝粗多糖10 mL/（d·kg）]。連續灌胃7 d，試驗期間，小鼠可自由進食進水。

1.3 檢測指標

1.3.1 小鼠體重變化和器官指數。

每天灌胃前，稱重，觀察并記錄各組小鼠體重的變化。距離最后一次給藥24 h后，摘眼球取血后，脫頸椎處死小鼠，迅速解剖，取出器官，稱重，計算出器官指數。

器官指數=臟器質量（mg）/小鼠體重（g）

1.3.2 小鼠血常規指標和免疫學指標。小鼠處死前，摘眼球，取血200 μL到1.5 mL肝素抗凝離心管中，于血細胞分析儀上機檢測。

1.3.3 小鼠骨髓細胞微核觀察。小鼠脫脊椎處死后，解剖，取胸椎骨，剔除肌肉，用止血鉗固定胸椎骨的前端，剪斷骨后端，擠血到已有小牛血清的載玻片上，混勻，推片，室溫晾干;于甲醇中浸泡15 min，取出，室溫晾干;Giemsa染色15 min，沖洗，室溫晾干。于10倍鏡下選擇細胞分布均勻的區域，100倍鏡下計數每只小鼠6 000個嗜多染紅細胞（PCE）中帶微核細胞（MN）數，計算出微核率，微核率以千分率表示。

微核率=微核數（個）/觀察細胞數（個）×1 000‰

1.3.4 小鼠精子觀察。

小鼠脫脊椎處死后，解剖，取兩側附睪到生理鹽水中，混勻，制備精子懸液。吸取精子懸液滴于載玻片上，推片，室溫晾干;于甲醇中浸泡5 min，室溫晾干;2%伊紅水溶液染色1 h，沖洗，室溫晾干。

于10倍鏡下找到精子重疊少的區域，100倍鏡下計數。每只小鼠計數200～500個精子，觀察畸形精子數，計算精子畸變率，以百分率表示。

畸變率=畸形精子（個）/觀察總精子數（個）×100%

2 結果與分析

2.1 貽貝粗多糖的含量及對免疫抑制小鼠體重的影響

經硫酸-苯酚法測得的含糖量為70%。由表1可知，試驗第1天，各組間小鼠體重差異不顯著。與對照組相比，灌胃第7天模型組小鼠和連續7 d服用貽貝粗多糖的正常小鼠（貽貝粗多糖組）體重顯著下降（P<0.05）。對比模型組，低、高劑量組的體重仍顯著偏低（P<0.05）。貽貝多糖降低小鼠體重的現象，與李孟婕等[9]的研究結果一致，其中的機制可能是多糖能促進腸道蠕動[12]，加快機體新陳代謝速度，以及小鼠原本的個體差異，進食進水、精神狀態等[13]都會對體重產生影響。

2.2 貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠器官指數的影響

器官指數能直觀反映外源化合物對臟器的影響[14]，其中胸腺和脾臟指數是評判機體免疫能力的重要指標[15]，通過對比胸腺指數和脾臟指數，反映環磷酰胺對機體先天免疫的損傷。由表2可知，與對照組相比，模型組的胸腺指數顯著降低（P<0.05），脾臟指數下降但無顯著性差異，腸指數和心臟指數分別顯著升高73.4%、43.6%（P<0.05）。林帥等[16-18]等研究發現，同一時期暴露在等濃度的環磷酰胺下，與脾臟指數相比，胸腺指數下降幅度更大，這與該試驗結果一致，可能是由脾臟和胸腺的作用功能、組織結構的差異造成，短期攝入環磷酰胺對胸腺氧化應激損傷，導致胸腺萎縮[19]，器官指數顯著下降。模型組小鼠的心臟和腸腫大，原因可能是環磷酰胺能提高體內炎性因子水平[20]，出現局部腫脹的現象。對比模型組，貽貝粗多糖組和低、高劑量組的胸腺指數有所上升，腸指數下降，但均無顯著差異，心臟指數顯著下降（P<0.05）。貽貝多糖經證實有抗炎[21]和抗氧化[10]的效果，結合該試驗結果，貽貝粗多糖可能通過降低機體內的炎性因子水平，緩解心臟、腸器官腫脹;能減輕氧化應激對胸腺的損傷，促進胸腺正常生長發育，但具體機制尚不清楚。

2.3 貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠血液常規指標的影響

血液中含有大量的免疫細胞[22]，測定機體血液內免疫細胞組成和體表變化是評定機體穩態和免疫能力的指標之一。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠WBC、PLT 、RBC、 MCV、 HCT顯著降低（P<0.05），HGB有所下降，但差異不顯著（P>0.05），說明環磷酰胺誘導小鼠的免疫細胞數目顯著下降，免疫能力降低。對比模型組，灌胃貽貝粗多糖小鼠WBC、PLT 、RBC、HGB、 MCV、 HCT的水平提高，除WBC顯著升高外（P<0.05），其他均無顯著差異。2個劑量組之間的血液常規指標無顯著差異（P>0.05），但總體上看，低劑量組提升效果更好。環磷酰胺并不是靶向藥，在攻擊腫瘤細胞的過程中，會對骨髓等其他組織造成一定的損傷[23]。骨髓是白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板發育分化的地方，當骨髓遭到破壞，抑制骨髓造血干細胞分化成不同的免疫細胞的進程[24]，減少機體內免疫細胞的數量，降低機體的整體免疫能力。結果表明，貽貝粗多糖能促進免疫細胞的增殖及骨髓抑制狀態。

2.4 貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠免疫學指標的影響

由表4可知，與對照組相比，模型組LYM顯著提高25.7%（P<0.05），MID、GRAN顯著下降52.2%、85.7%（P<0.05）。對比模型組，低、高劑量組的MID、GRAN占比升高，LYM下降，差異均無統計學意義。低、高劑量組之間的LYM、MID、GRAN的百分比無顯著差異（P>0.05）。說明貽貝粗多糖可以調節LYM、MID、GRAN，且三者之間的比例趨于正常水平，能維持機體免疫功能的穩定。

2.5 貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠骨髓細胞微核率的影響

比較不同劑量組之間的嗜多染紅細胞的微核率，檢測灌胃7 d環磷酰胺在小鼠體內產生遺傳毒性的大小[25]以及貽貝粗多糖的緩解作用。由表5可知，在觀察同樣的細胞總數中，與對照組相比，模型組的微核率提高近10倍。對比模型組，低劑量試驗組的微核率降低6.33千分點、高劑量試驗組降低10.33千分點。環磷酰胺是烷基化劑，在機體內轉化為次級代謝物，生成烷基化DNA、RNA和蛋白質引起DNA單鏈斷裂[26]，遺傳物質損傷出現微核異常現象[27]。試驗結果表明，貽貝粗多糖可能有效抑制環磷酰胺誘導的致突變作用。

2.6 貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠精子的影響

統計畸形精子的數目，檢測短期灌胃環磷酰胺引起生殖細胞遺傳損傷[28]以及貽貝粗多糖的緩解作用。由表6可知，與對照組相比，模型組的精子畸變率升高7.77百分點，貽貝粗多糖組下降0.55百分點。經過貽貝粗多糖干預后，對比模型組，低、高劑量試驗組分別降低精子畸變率2.85、6.68百分點。服用環磷酰胺等化療藥物，會導致性腺功能出現障礙，改變精子的染色體結構，使精子外形異常[29]。該試驗結果說明，貽貝粗多糖能降低環磷酰胺對精子的損傷，且高劑量的保護作用效果優于低劑量。

3 結論

該試驗研究木瓜蛋白酶提取的貽貝多糖對免疫抑制小鼠的免疫功能、生殖能力和遺傳穩定性的作用效果。結果表明，環磷酰胺誘導小鼠白細胞、紅細胞等免疫細胞數量顯著下降，導致淋巴細胞百分比明顯偏高，中性粒細胞百分比明顯偏低，說明小鼠體內的免疫平衡紊亂，抑制小鼠固有免疫、細胞免疫能力，提示環磷酰胺不僅對胸腺、脾臟造成損傷，還對生長、發育、分化免疫細胞的器官產生毒作用。服用貽貝粗多糖能降低免疫抑制小鼠心臟、腸器官指數，升高胸腺指數，增加白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板的含量，使淋巴細胞、中間細胞、中性粒細胞的百分比趨于正常，表明貽貝粗多糖可能通過抗炎作用抑制部分器官腫脹，還通過修復環磷酰胺對免疫器官損傷，增強細胞免疫的作用。環磷酰胺誘導精子畸變和微核率升高，補充高劑量的貽貝粗多糖能降低微核率和精子致畸率，說明貽貝粗多糖能緩解環磷酰胺導致的遺傳毒性和生殖毒性。該研究探明了貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的作用，為開發貽貝粗多糖免疫調節劑提供了理論參考。

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