一種牛肉檢測的熒光實時定量方法研究

馬建榮 余永紅 何遠財 張雅慧 譚杰峰 崔水龍 許錦濤

摘要 [目的]開發一種用于牛源性成分檢測的熒光實時定量檢測方法。[方法]通過序列比對后，以牛源性線粒體DNA中cytb基因為模板，設計特異性的引物和探針，并以不同來源的DNA為模板，分析引物和探針的特異性。對牛源性DNA進行梯度稀釋后，分析不同濃度下擴增曲線，分析檢測方法的靈敏度。以牛源性DNA稀釋液為模板，進行10個平行擴增試驗，分析檢測方法的精密度。[結果]該研究所用的引物和探針對牛源性DNA具有明顯的擴增曲線，而對非牛源性（雞、鴨、豬、人）DNA模板不進行擴增。靈敏度分析結果顯示，該檢測方法對濃度僅為24.4 pg/μL牛源性DNA模板仍進行陽性擴增。精密度分析顯示，10個平行試驗擴增曲線相似，Ct值的標準差（SD）僅為0.41，精密度（CV）也僅為1.6%。[結論] 該研究開發的牛肉成分檢測的熒光實時定量方法特異性高，僅對牛源性DNA發生擴增。同時該方法靈敏度也很好，檢出限為24.4 pg/μL，精密度也很高，重復性良好，適用于市場上肉制品中牛源性成分的檢測。

關鍵詞 牛源性成分;熒光實時定量方法;引物特異性;靈敏度;精密度

中圖分類號 TS 251.7? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）03-0198-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.052

Study on a Fluorescence Real-time Quantitative Method for Beef Detection

MA Jian-rong， YU Yong-hong， HE Yuan-cai et al

（Guangdong Food and Drug Vocational College， Guangzhou， Guangdong 510520）

Abstract [Objective] To establish a real-time fluorescence quantitative detection method for the detection of bovine-derived components.[Method] After sequence alignment， specific primers and probe were designed based on the cytb gene of bovine mitochondrial DNA， and the specificity of primers and probe was analyzed with different DNA samples. The detection method was also analyzed with gradient dilution samples of bovine DNA. Ten parallel amplification experiments were carried out using bovine DNA dilution as template to analyze the precision of the detection method. [Result] The primers and probes used in this study had obvious amplification curves for bovine-derived DNA， but do not amplify non-bovine-derived （chicken， duck， pig， human） DNA templates.Sensitivity analysis results showed that the detection method still positively amplified bovine-derived DNA templates with a concentration of only 24.4 pg/μL.Precision analysis showed that the amplification curves of the 10 parallel experiments were similar， the standard deviation （SD） of the Ct value was only 0.41， and the precision （CV） was only 1.6%.[Conclusion] The fluorescence real-time quantitative method for beef component detection developed by this research has high specificity and only amplifies bovine-derived DNA.At the same time， the sensitivity of the method is very good， the detection limit is 24.4 pg/μL， the precision is also high， and the repeatability is good. It is suitable for the detection of bovine-derived components in meat products on the market.

Key words Bovine-derived components;Real-time fluorescence quantitative method;Primer specificity;Sensitivity;Precision

基金項目 廣東省大學生“攀登計劃”專項資金（pdjh2020b1009）;廣州市科技計劃項目（202002030422）;廣東食品藥品職業學院院級課題（2019ZR13，2019ZR17，2020ZR03）。

作者簡介 馬建榮（1981—），女，河北唐山人，實驗師，碩士，從事微生物相關的教學與科研工作。通信作者，講師，博士，從事微生物基礎代謝相關研究。

收稿日期 2021-05-21

牛肉具有營養價值高、口感佳等特點，深受消費者喜愛。隨著我國經濟飛速發展、生活水平提高，飲食結構日益豐富，也使得我國牛肉總消費量、人均消費量都逐年穩步提高，2011—2019年我國牛肉消費總量從552萬t增長至883萬t，累計增長59.96%，年均增長6.66%[1]。但與消費需求相比，我國的牛肉產量明顯不足，牛肉進口量也不斷增加，且牛肉制品的銷售價格也不斷攀升[1-2]。

由于牛肉價格偏高，無良商家以此為“商機”，將其他價格較低的肉類（如豬肉、鴨肉等）加工制成所謂的“牛肉制品”，降低成本，使用錯誤或偽造的標簽蒙騙消費者，從中牟取暴利[3]。近年來，此類“摻雜使假”事件屢有發生，嚴重損害消費者權益[4]。為更好保護消費者利益，相關部門為各類肉制品的鑒定提供了有效方法，但隨著造假技術和工藝水平的提高，單純依賴于感官鑒別和經驗判斷已經不能滿足當前市場監管等方面的需求，而氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法（GC-MS）等方法又具有花費時間長、操作過于煩瑣以及結果滯后等缺點，因此開發快速、有效且特異性強的檢測方法非常有必要[5]。

隨著分子生物學技術的發展，以核酸DNA為靶標的檢測技術被陸續開發出來，其中聚合酶鏈式反應（PCR）由于速度快、靈敏度高且簡便可靠，已經發展成為一種成熟的食品摻假檢測技術[6]。同時科技的不斷革新產生了眾多新的技術，如多重PCR[7-8]、實時PCR[9]、LAMP（環介導等溫擴增）[10]、數字PCR[11]等，為肉類鑒定提供了更多的鑒定手段。實時PCR包含熒光染料法和熒光探針法2種方法，其中熒光染料法可靠穩定、靈敏度高，但容易發生非特異性擴增而影響檢測結果;相比之下熒光探針法有更強的特異性，能快速特異擴增目標序列[12]。為建立簡便、快捷、高效的牛肉檢測方法，該研究開發了一種基于牛源性線粒體細胞色素b基因（cytb）的熒光探針法實時PCR技術[13]。

1 材料與方法

1.1 引物和探針設計

從NCBI網站分別下載牛、豬、鴨和人的線粒體細胞色素b基因（cytb）序列，通過比對篩選出牛源性cytb基因的保守序列，并利用Primer Premier 5.0軟件設計出特異性的引物和探針，并對探針5′端用FAM修飾，3′端用BHQ1修飾。該研究采用的

上游引物序列為5′-GCAATACACTACACATCC-3′，下游引物序列為5′-TGAAGCTCCGTTTGCG-3′，探針序列為5′-FAM-CTCCTCTGTTACCCATATCTGCCG-BHQ1-3′。

1.2 樣品DNA制備

從市場購買的牛肉、鴨肉、豬肉、雞肉，并取內層組織作為樣品提取DNA。人源性DNA來源于人口腔上皮細胞。不同樣品的DNA提取過程參照索萊寶公司的動物組織DNA提取試劑盒進行。

1.3 反應體系與反應條件

反應總體系為20 μL，內含PCR Mix 12.18 μL、Taq酶0.32 μL、模板DNA 5 μL，上游引物、下游引物和探針混合物2.5 μL。反應條件是95 ℃預變性2.5 min，93 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，45個循環。

1.4 特異性試驗

分別以4種非牛源性（豬、雞、鴨以及人源）DNA和牛源性DNA為模板，用“1.3”反應條件和反應體系進行實時定量PCR擴增，根據擴增曲線和反應體系中熒光信號到達設定閾值時所需循環數（Ct值），判斷引物和探針的特異性。

1.5 靈敏度試驗

將牛源性DNA樣品進行梯度稀釋，終濃度分別為100.00 ng/μL、25.00 ng/μL、6.25 ng/μL、1.56 ng/μL、0.39 ng/μL、97.60 pg/μL、24.40 pg/μL，并將這7種稀釋液樣品分別編號為D1～D7。以D1～D7樣品為模板進行實時定量PCR擴增，判斷該檢測方法的靈敏性。

1.6 精密度試驗

選取D4樣本（濃度為1.56 ng/μL）作為精密度試驗的模板DNA，設置10個平行試驗并分別編號為J1～J10，用“1.3”反應條件和反應體系進行實時定量PCR擴增，根據擴增曲線和Ct值，計算出標準差（SD）、平均值（）、精密度（CV）。

精密度計算公式為CV=SD×100%。

2 結果與分析

2.1 引物和探針的特異性檢測

為驗證該研究所用引物和

探針的特異性，以不同來源的DNA作為模板，以“1.3”的反應體系和反應方法進行實時定量擴增，結果顯示（圖1），針

對牛源性線粒體細胞色素b基因（cytb）設計的引物和探針，

以豬、雞、鴨、人來源的DNA和陰性對照（H2O）為模板時，熒光強度差值（ΔRn）小于0.05，說明該反應體系對其他物種來源的模板沒有擴增。而當以牛源性DNA為模板時，ΔRn值超過3.5，顯示顯著性擴增反應。以上結果說明該研究所用的引物和探針具有較高的特異性，能滿足后續試驗需求。

2.2 引物和探針的靈敏性檢測

按照“1.5”方法操作，結果顯示（圖2），100.00 ng/μL、25.00 ng/μL、6.25 ng/μL、1.56 ng/μL、0.39 ng/μL、97.60 pg/μL和24.40 pg/μL這7個稀釋度的樣品均出現典型的擴增曲線，并且隨著稀釋度增加，Ct值逐漸增大，擴增曲線逐漸右移。樣品D7中牛源性DNA濃度非常低，雖出現典型的擴增曲線，但Ct值為32.38，ΔRn值也僅為1.05，因此當Ct值大于33時，可判定為未檢出牛源性成分。

2.3 檢測方法的精密度分析

按照“1.6”方法操作，結果顯示（圖3），陰性對照沒有發生擴增，而所有平行試驗都發生了陽性擴增，熒光強度（Rn）約3.5，且Ct值較為接近。

對每個平行擴增試驗獲得的Ct值進行統計分析，10個平行試驗所得Ct值的平均值（）為26.67，標準差（SD）為0.41，平行間的精密度（CV）為1.6%。以上分析結果表明該研究建立的牛肉檢測體系穩定性較高，具有良好的精密度，能滿足檢測需求。

3 結論與討論

該研究以牛源性線粒體中cytb基因為靶標，利用同源性比對后對特異性的位點設計了特異性的引物和探針，開發了新的熒光定量PCR檢測方法。首先檢測了引物和探針的特異性，結果發現該研究所采用的擴增引物和探針對牛源性DNA模板具有非常顯著的擴增反應，而對雞、鴨、豬和人來源的DNA模板無擴增反應，說明引物和探針的特異性非常高。

進一步分析檢測方法的靈敏度，結果顯示該方法對牛源性DNA模板的靈敏度很高，最低檢測濃度可達到24.40 pg/μL，顯著低于文獻報道的熒光PCR法（0.2 ng/μL）[14]和多重位點特異性PCR方法（100 pg/μL）[7]。但海小等[15]報道的基于Taqman探針的定量PCR方法對水牛源性成分的最低檢測限度可達10 fg/μL，遠低于該研究的檢測限度，說明該研究方法在靈敏度方面還需進一步優化提升。

為分析該研究檢測方法的重復性和精密度，分析了10個平行試驗的重復性，結果發現精密度良好，平行間Ct值標準差僅為0.41，精密度（CV）為1.6%，也說明該檢測方法的穩定性良好。

綜合分析，該研究的檢測方法具有特異性高、靈敏度好、

精密度高等優勢，適用于市場上肉制品中牛源性成分的檢

測，并且該檢測操作簡單快捷，可進行批量檢測，符合當今市

場的監測需求，可作為常規檢測方法來使用。

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