雞胗中百菌清及其代謝物殘留量檢測

陳美君 左海根 劉小玉 張德繼 王和雨 杜永琴 黃英杰

摘要 [目的]建立一種能同時檢測雞胗中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留量的測定方法。[方法]雞胗試樣與無水硫酸鈉混合后充分研磨，乙腈提取，濃縮定容后采用液相色譜儀測定。[結果]百菌清及其代謝物4-羥基百菌清在該色譜條件下得到很好的分離，百菌清和4-羥基百菌清濃度在0.05～1.00 mg/L呈較好的線性（R2>0.999）。添加水平為0.02～0.08 mg/kg時添加回收率為74%～106%，相對標準偏差為1.6%～16.3%，方法定量限均為0.02 mg/kg。[結論]該方法具有樣品前處理簡單快速、靈敏度高、檢測成本低的特點，可應用于雞胗中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留量的檢測。

關鍵詞 百菌清;4-羥基百菌清;代謝物;殘留;液相色譜儀

中圖分類號 TS 207.5+3? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）03-0201-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.053

Detection of Chlorothalonil and Its Metabolite Residues in Gizzards

CHEN Mei-jun， ZUO Hai-gen， LIU Xiao-yu et al

（School of Chemistry and Food Science， Nanchang Normal University， Nanchang，Jiangxi 330032）

Abstract [Objective]To establish a method for the determination of chlorothalonil and its metabolite 4-hydroxychlorothalonil residues in gizzards.[Method]The gizzards sample was grinded with anhydrous sodium sulfate， extracted with acetonitrile， and detected by high performance liquid chromatography with UV detector.[Result] Chlorothalonil and 4-hydroxychlorothalonil were good in linear relationship between 0.05 -1.00 mg/L（R2>0.999）. When the addition levels were 0.02-0.08 mg/kg， the recovery rates were 74%-106%， the relative standard deviations were 1.6%-16.3%， and the method quantification limits were 0.02 mg/kg.[Conclusion]The method has the characteristics of simple and rapid sample pretreatment， high sensitivity and low detection cost， and can be applied to the detection of the residual amount of chlorothalonil and its metabolite 4-hydroxychlorothalonil in gizzards.

Key words Chlorothalonil;4-hydroxychlorothalonil;Metabolites;Residues;Liquid chromatography

基金項目 南昌師范學院2019年學生科研項目（19XSKY44）;南昌師范學院2021年學生科研項目（21XSKY47）;南昌師范學院博士基金項目（NSBSJJ2019001）。

作者簡介 陳美君（2001—），女，四川威遠人，從事食品安全研究。通信作者，副教授，博士，從事食品安全檢測研究。

收稿日期 2021-09-13

隨著人民物質生活的不斷提高，食品安全問題備受關注。雞胗因肉質厚實，深受人們的喜愛。雞胗是雞的砂囊，主要功能是儲存和磨碎食物，極易吸收食物中的藥物殘留，因而監測雞胗中藥物殘留量顯得十分必要。

百菌清是一種非內吸性廣譜殺菌劑，對多種作物的真菌病害具有防治作用，主要通過與真菌細胞中的3-磷酸甘油醛脫氫酶發生反應，酶體中含有半胱氨酸的蛋白質被結合，喪失酶的活性，使真菌細胞的新陳代謝遭到破壞而失去生命力[1]。百菌清對生物具有一定的毒性[2-4]。尤其是百菌清在環境中易被代謝為4-羥基百菌清，其毒性約為百菌清母體的30倍[3]。另外，4-羥基百菌清的遷移性、持久性較母體也有明顯增加[5-6]。基于百菌清對環境構成的潛在威脅，被美國國家環境保護總署列為可能使人類致癌的物質之一[7-8]。我國的國家標準GB 2763—2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》對食品中百菌清和4-羥基百菌清的最大允許殘留限量進行了嚴格規定，禽類內臟中百菌清（以4-羥基百菌清計）的最大殘留限量為0.07 mg/kg。

當前人們對百菌清殘留量的分析技術開展了較深入的研究，但主要集中于百菌清母體的檢測[9-14]。對于百菌清及其代謝物殘留檢測技術的報道較少，主要包括免疫分析法[15-16]、高效液相色譜法（HPLC）[17]、氣相色譜法（GC）[18]、氣相色譜質譜法（GC-MS）[19]和液相色譜質譜法 （HPLC-MS）[19-21]。當前百菌清及其代謝物殘留量檢測還主要集中在環境及植物源食品中檢測[15-21]，但應用于禽類內臟的檢測方法以及百菌清在動物體內代謝規律研究鮮見報道。筆者將建立同時檢測家禽中百菌清及4-羥基百菌清殘留量的檢測方法，為后續開展百菌清在家禽體內代謝規律研究奠定基礎，也為保障家禽產品的安全提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試材

乙腈（液相色譜級，美國TEDIA公司）;無水硫酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;百菌清標準品（100 mg/L，中國環境監測站）;4-羥基百菌清標準品（純度99.7%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）;針孔濾膜（有機相0.45 μm）;試驗用水為超純水。雞胗試樣（購于南昌某超市）。

4-羥基百菌清標準儲備溶液（100 mg/L）：準確稱取10 mg 4-羥基百菌清標準品，用乙腈溶解并定容至100 mL，冰箱中避光保存。

混合標準溶液（1 mg/L）：分別移取1 mL百菌清標準溶液（100 mg/L）和4-羥基百菌清（100 mg/L）于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，冰箱中避光保存。

1.2 儀器

Waters 1525-2489液相色譜儀，包括四元泵、在線真空脫氣機、柱溫箱、自動進樣器和紫外檢測器（UV）;QL-902漩渦混合器;HY-8調速振蕩器;RE-2000A旋轉蒸發器;移液槍;NC-BY20超純水裝置。

1.3 色譜條件

安捷倫公司TC C18色譜柱（150 mm×4.8 mm，5 μm）;柱溫25 ℃，進樣量10 μL;紫外檢測器波長243 nm;流動相為乙腈-水，梯度洗脫條件見表1。

1.4 試驗方法

將雞胗剪成小塊，用刀式研磨儀攪碎混勻。準確稱取雞胗試樣5.0 g于研缽中，加入30 g無水硫酸鈉，研磨至干粉狀。將研磨好的試樣轉移至250 mL錐形瓶中，加入40 mL乙腈溶液，在振蕩儀上振蕩15 min后，靜置分層，將上層液過無水硫酸鈉柱后收集于250 mL濃縮瓶中。殘渣中再加入20 mL乙腈重復提取2次，合并上清液后在40 ℃水浴中旋轉濃縮至干。準確移取2 mL乙腈于濃縮瓶中，渦旋溶解后過有機相針孔濾膜，供液相色譜儀測定。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件選擇

為了比較不同的提取溶劑對雞胗中百菌清、4-羥基百菌清的提取效率的影響，采用比較不同提取溶劑（乙腈、乙酸乙酯、正己烷）對目標化合物的提取效率。研究表明，乙腈提取效率最佳，這是由于4-羥基百菌清具有一定的極性，更適合用乙腈提取。另外乙腈具有穿透性強、提取雜質少的特點，該研究選擇乙腈作為提取溶劑，這與相關的報道一致[22]。

為了進一步提高4-羥基百菌清的提取效率，對提取方式進行了選擇和優化，結果表明，樣品與無水硫酸鈉混合研磨除水后，再采用乙腈提取，4-羥基百菌清和百菌清具有較好的提取效率。這是因為劇烈的研磨過程能進一步破壞雞胗的組織結構，有助于乙腈的提取，而且能有效除去組織中的水分。

2.2 檢測條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇。

為了選擇較佳的色譜柱，對不同的色譜柱進行標準品檢測，根據目標化合物的峰形和響應值選擇最佳的色譜柱。百菌清及其代謝物屬于極性較小的化合物，因此采用弱極性色譜柱進行分析，結果表明不同型號的色譜柱對分離存在一定的差異。該研究分別采用色譜柱1（Agilent TC C18，150 mm×4.8 mm，5 μm）和色譜柱2（Kromasil NH2，250 mm×4.8 mm，5μm）進行分離，結果表明，色譜柱1能將百菌清及其代謝物4-羥基百菌清有效分離，峰形好，靈敏度高;而色譜柱2不能有效分離，不適合作為分離色譜柱。因而選擇色譜柱1作為分離柱。

2.2.2 流動相的選擇。

考察了乙腈-水、甲醇-水作為流動相時對百菌清及其代謝物色譜行為的影響，結果表明，乙腈-水作為流動相的響應值較高，故選用乙腈-水作為流動相。另外，流動相的比例對目標物的分離也有較大的影響，結果見圖1。

從圖1可以得出，當采用等比例的流動相洗脫時，當乙腈的初始含量為70%，目標物雖然能達到基線分離，峰形較好，但保留時間較小。隨著乙腈含量的進一步增加，色譜峰型變差。因而該研究采用梯度洗脫方式，得到較好的峰型和較高的靈敏度（圖1e）。

2.2.3 檢測波長的選擇。

首先研究了百菌清和4-羥基百菌清的最大吸收波長，發現這2種化合物的最大吸收波長不一致，分別為243和233 nm，綜合考慮，選擇243 nm作為檢測波長。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系及定量限。

配制0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的系列標準溶液。按照“1.3”色譜條件進行測定后，得到百菌清和4-羥基百菌清均呈現較好的線性，線性決定系數（R2）分別為0.999 9和0.999 8。試驗以10倍信噪比計算定量限，得到雞胗樣品中百菌清和4-羥基百菌清的定量限均為0.02 mg/kg。

2.3.2 回收率和精密度。

在陰性雞胗樣品中分別添加0.02、0.04和0.08 mg/kg，百菌清的回收率為74%～84%，精密度為3.0%～10.5%;4-羥基百菌清的回收率為86%～106%，精密度為1.6%～16.3%。雞胗樣品測定對應的標準品、空白、樣品和樣品添加的液相色譜圖見圖2。

3 結論

該研究建立了一種同時檢測雞胗中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留量的測定方法，該方法前處理簡便、回收率穩定、測定結果準確、成本低廉，可用于雞胗中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留量的檢測，為雞胗中百菌清及其代謝物殘留量監測提供一定的技術支持。

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