春夏季茶樹兒茶素生物合成基因表達差異

黃芳芳，熊立瑰,3，李 瑩，劉仲華,3，黃建安,3,*，李 娟,3,*

（1.湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術研究中心， 湖南 長沙 410128；3.湖南省植物功能成分利用省部共建協同創新中心，湖南 長沙 410128）

類黃酮是植物體內主要的次生代謝產物，具有重要的生理作用，如調節生長素的運輸、紫外線防護、幫助植物防御病原體和抵抗不良環境等[1-2]，茶樹體內豐富的兒茶素類屬于類黃酮類物質，兒茶素類在茶樹體內的分布和積累受到多方面的調控，不同發育階段兒茶素類的含量存在差異且不同器官中呈現不同的變化規律[3]；光質和光強影響兒茶素類的合成，遮光條件下兒茶素類含量下降[4]；不同茶樹品種兒茶素類含量也具有較高的變異性[5]。苯丙烷生物合成途徑是植物中最典型的次生代謝途徑之一，兒茶素類是苯丙烷生物合成途徑的衍生物[6]。如圖1所示，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）的作用下脫氨生成反式肉桂酸，反式肉桂酸通過肉桂酸羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）催化的氧化反應轉化成對香豆酸，4-香豆酸CoA連接酶（4-coumaroyl，4CL）激活硫酯化反應將對香豆酸轉化成香豆酰CoA，然后進入類黃酮生物合成途徑生成非酯型兒茶素[7]。查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）可以催化香豆酰CoA和丙二酰CoA轉變成查耳酮，查耳酮在查耳酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）的催化下C環閉合異構化形成黃烷酮，黃烷酮在黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）、類黃酮3′-羥化酶（flavonoid 3′-hydroxylase，F3′H）以及類黃酮3′,5′-羥化酶（flavonoid 3′,5′-hydroxylase，F3′5′H）的催化下發生羥基化反應形成二氫黃酮醇，二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）可將二氫黃酮醇還原成無色花青素，無色花青素在無色花色素還原酶（leucoanthocyanidin reductase，LAR）、花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）以及花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）的作用下形成非酯型兒茶素，進一步形成酯型兒茶素[8-9]。茶樹酯型兒茶素的沒食子酰基化合成途徑涉及兩步反應，第1步為沒食子?；幕罨?，即葡萄糖基轉移酶（UDP-glucose:galloyl-1-O-β-D-glucosyltransferase，UGGT）催化沒食子酸（gallic acid，GA）和尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glucose，UDPG）形成沒食子?；咸烟牵?步是沒食子酰基的轉移，沒食子?；咸烟呛?,3-順式黃烷-3-醇在表兒茶素沒食子?；?葡萄糖-O-沒食子?；D移酶（epicatechin:1-O-galloyl-β-D-glucose-O-galloyltransferase，ECGT）的作用下形成酯型兒茶素[10-12]。

圖 兒茶素生物合成途徑Fig. 1 Catechin biosynthetic pathways

兒茶素類生物合成酶編碼基因的相對表達量在不同嫩度的茶樹鮮葉以及茶樹不同組織中的表達差異受到了廣泛的關注[13-15]，白化茶樹葉片發育不同時期兒茶素類水平及相關基因表達的變化也有報道[16]，Liu Min等[17]研究了春秋季不同茶樹品種的兒茶素類含量與調控兒茶素合成酶基因表達的相關性，但是春夏季茶樹品種兒茶素生物合成相關基因表達的差異尚鮮見報道。福鼎大白茶、櫧葉齊為國家級良種，在全國范圍內推廣面積大，品質穩定[18-19]，碧香早與白毫早為湖南省主栽茶樹品種，茶樹生長速度快、適應性較強[20]，因此本研究選取福鼎大白茶、白毫早、碧香早、櫧葉齊茶樹品種為原料，研究春夏季茶樹體內兒茶素類含量以及兒茶素類生物合成基因表達的差異，旨在探究春茶和夏茶之間兒茶素類含量與生物合成基因之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福鼎大白茶、白毫早、碧香早、櫧葉齊茶樹鮮葉，采摘時間為2020年3月28日和7月24日，采摘標準為一芽二葉，采摘地點為湖南省茶葉研究所高橋實驗茶場。鮮葉采摘后迅速用液氮冷凍，-80 ℃保存備用。

N,N-二甲基甲酰胺（色譜純） 天津市化學試劑研究所；冰醋酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、碳酸鈉、福林-酚試劑 國藥集團化學試劑有限公司；GA標準品（90.34%）、兒茶素標準品、可可堿標準品（95%）、茶堿標準品（99%） 美國Sigma公司；RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix（TaKaRa）、TB Green?Premix ExTaq? II（TaKaRa） 上海百賽生物技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

真空冷凍干燥儀 美國熱電公司；LC-2010AHT高效液相色譜儀、UV-2250紫外分光光度計 日本島津公司； MS204TS/00型電子分析天平 美國Mettler Toledo公司； DSY-2-8水浴鍋 常州國華有限公司；低速離心機 北京雷勃爾離心機有限公司；QuantStudioTM3熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Nanodrop 2000/2000c核酸濃度測定儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 兒茶素組分以及茶多酚含量的測定

茶樹鮮葉真空冷凍干燥后用研磨機研磨成粉末，用于提取茶湯，茶多酚的測定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，測定兒茶素組分的茶湯采用水提，即稱取0.6 g茶粉（準確至0.000 1 g）于100 mL錐形瓶中，加入90 mL沸蒸餾水后立即移入沸水浴中，浸提45 min（每隔10 min搖動一次），浸提完畢后趁熱過濾，冷卻后定容至100 mL，茶湯過0.45 μm濾膜后，采用高效液相色譜方法測定兒茶素組分，色譜程序參照文獻[21]。

1.3.2 RNA提取和cDNA的合成

樣品總RNA提取采用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN），RNA濃度的測定通過Nanodrop 2000/2000核酸濃度測定儀，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit （TaKaRa）合成cDNA并于-20 ℃保存待用。實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）分析采用TB Green?Premix ExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa），每個樣品重復3 次。所用引物參照已發表的文獻，內參基因為GAPDH，序列如表1所示。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數據處理與分析

數據用GraphPad Prism 8作圖，基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算，SPSS 25.0分析數據，春夏季兒茶素組分、茶多酚含量以及基因相對表達量比較運用t檢驗，不同品種茶樹鮮葉基因表達量的差異采用單因素方差分析，根據Duncan新復極差法進行多重比較，Pearson相關系數作相關性分析。

2 結果與分析

2.1 春夏季茶樹茶多酚含量分析

茶樹體內豐富的多酚類物質是茶樹新陳代謝的特征產物，茶多酚含量決定茶葉的品質風格，本研究測定不同品種茶樹春夏季茶多酚的含量，圖2結果表明，夏季茶多酚的含量極顯著高于春季（P＜0.01），這與已有研究中茶樹新梢中茶多酚含量夏梢＞秋梢＞春梢[25-26]結果相似。隨著夏季氣溫升高，光照增強，茶樹體內的碳素代謝增強，因此茶多酚含量較高[26]。

圖2 茶多酚含量Fig. 2 Polyphenol contents of tea shoots from different cultivars

2.2 兒茶素組分含量分析

兒茶素的組成及含量反映茶樹的品質[27]，茶樹體內主要的兒茶素組分包括：C、EC、EGC、EGCG、ECG、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、GCG[28]。本研究采用高效液相色譜法測定以下兒茶素組分的含量，其中包括非酯型兒茶素（EGC、D,L-兒茶素（D,L-catechin，D,L-C）和EC）以及酯型兒茶素（EGCG、GCG、ECG）。如表2所示，酯型兒茶素含量高于非酯型兒茶素，夏季非酯型兒茶素和酯型兒茶素類含量均高于春季，且不同茶樹品種春夏季非酯型兒茶素的差異均具有顯著差異（P＜0.01），由此可知，夏季兒茶素總量（所測定兒茶素組分含量的總和）也高于春季。春季酯型兒茶素所占比例為79.52%～84.45%，夏季酯型兒茶素所占比例為67.96%～73.81%，夏季酯型兒茶素的比例低于春季，非酯型兒茶素的比例高于夏季。如圖3所示，酯型兒茶素組分中EGCG含量最高，非酯型兒茶素中EGC含量最高，D,L-C以及EC含量較低，這與前人報道一致[29]。夏季兒茶素組分中EGC、D,L-C、EC及ECG的含量高于春季且春夏季EGC、EC、ECG的含量存在顯著差異，早期研究結果表明，同位素標記的EC滲入茶樹主要轉化成EGC，因此這可能是夏季茶樹鮮葉中EGC含量高于春季的原因[8]。

圖3 兒茶素組分含量Fig. 3 Contents of catechins in tea shoots from different cultivars

表2 兒茶素組分含量及比例Table 2 Contents and percentages of catechins in tea shoots from different cultivars

2.3 茶樹兒茶素類生物合成基因相對表達量

對兒茶素生物合成相關基因PAL、C4H、CHS、

F3H、F3′5′H、F3′H、DFR、LAR、ANS、ANR、4CL、UGT84A、UGGT的相對表達量進行了分析，結果如圖4 所示。F3H與DFR基因相對表達量有春季高于夏季的趨勢；白毫早LAR基因相對表達量夏季顯著高于春季 （P＜0.01），LAR催化無色花青素形成C，因此這可能是白毫早夏季D,L-C含量顯著高于春季的原因。F3′5′H基因與LAR基因表達趨勢一致，相對表達量均表現為福鼎大白茶、白毫早、碧香早中夏季極顯著高于春季 （P＜0.01），櫧葉齊中相對表達量為春季高于夏季，春季不同品種間相對表達量為碧香早＞櫧葉齊＞福鼎大白茶＞ 白毫早，夏季不同品種間相對表達量表現為碧香早＞ 福鼎大白茶＞白毫早＞櫧葉齊；PAL與4CL基因表達趨勢一致，福鼎大白茶、碧香早、櫧葉齊中相對表達量夏季高于春季，白毫早中相對表達量春季極顯著高于夏季 （P＜0.01），春季不同品種白毫早的相對表達量極顯著高于其他品種（P＜0.01），夏季不同品種間表達量為碧香早＞福鼎大白茶＞櫧葉齊＞白毫早；ANS基因與F3′H基因表達趨勢一致，福鼎大白茶、櫧葉齊、白毫早中相對表達量春季高于夏季，碧香早中相對表達量夏季極顯著高于春季（P＜0.01）。

圖4 兒茶素代謝相關基因相對表達量Fig. 4 Relative expression levels of genes related to catechin metabolism

根據基因相對表達量的結果，以春季白毫早樣品為參照，計算樣品各基因相對表達量的差異倍數（fold change，FC），并進行對數轉換（log2FC），結果如圖5所示，3月28日白毫早樣品ANS、C4H、CHS、UGT84A相對表達量與其他樣品存在差異（log2FC≤ -1），其F3′5′H基因相對表達量與其他樣品也存在差異（log2FC≥1）。由此可知，基因的表達不僅受季節的影響，還受到品種的影響。

圖5 基因相對表達量的log2FC值Fig. 5 log2FC values of relative gene expression

對兒茶素組分及總量與兒茶素生物合成基因相對表達量進行Pearson相關性分析，結果見表3。結果表明LAR、F3′5′H基因相對表達量與EGCG、ECG含量以及兒茶素總量存在極顯著正相關（P＜0.01）。此外，F3H基因相對表達量與EGC含量存在極顯著正相關 （P＜0.01），ANR、UGT84A基因相對表達量與D,L-C含量存在極顯著負相關（P＜0.01），UGGT基因相對表達量與其D,L-C含量極顯著正相關（P＜0.01）。

表3 兒茶素含量與生物合成基因相對表達量的相關性系數Table 3 Correlation coefficients between the accumulation of catechin and biosynthesis-related gene expression

3 討 論

茶多酚是茶樹中重要的次生代謝產物，其含量約占茶樹鮮葉的18%～36%。茶多酚由兒茶素類、黃酮類、花青素類、原花青素類以及酚酸類等構成，兒茶素不僅是茶葉中主要的澀味物質，而且茶多酚總量以及兒茶素組成及比例對茶樹的品質有重要影響[13]，茶樹中多酚類物質含量和組成與茶樹生長的環境條件、栽培措施、茶樹品種、季節以及新梢嫩度等密切相關[26,30]。夏季碳代謝增強，多酚類物質總量增加導致夏茶濃度與強度都較高[25]。

茶葉中的兒茶素以2-苯基苯并呋喃為主體，根據B、C環3位連接的基團不同，可分為EC、EGC、ECG、EGCG，各兒茶素組分中EC及其沒食子?；苌顴GC、ECG、EGCG大約占兒茶素總量的90%，兒茶素類含量約占多酚類物質的70%[8,17]，本研究結果表明EGC、ECG、EC夏季含量極顯著高于春季（P＜0.01），因此夏季兒茶素及茶多酚含量高于春季。Xu Wenping等[31]收集了160個具有代表性的樣品，檢測其兒茶素組分含量，結果表明夏茶EGC含量高于春茶，Liu Min等[17]研究春秋季茶樹兒茶素組分含量差異發現秋季EGC含量高于春季，且茶葉中的兒茶素多為表兒茶素[24]，因此EGC可能是造成不同季節間兒茶素總量差異的主要成分之一。EGCG是含量最豐富的兒茶素，不同季節EGCG含量的變化趨勢受到關注，已有研究表明不同季節EGCG含量表現為夏季＞秋季＞春季[24]，但袁英芳等[32]研究表明不同季節EGCG含量為夏季＞春季＞秋季，這可能是由于品種間的差異所造成，此外，前人研究多關注茶多酚含量、不同品種間兒茶素組分的差異，兒茶素組分之間的相互轉化以及茶樹不同部位兒茶素含量的差異等[15,25,33-34]，但是春季、夏季、秋季EGC及其他兒茶素組分含量差異還缺乏系統研究，不同季節間兒茶素組分的變化及原因還有待進一步探究。

本研究所測定的F3H、DFR基因相對表達量呈現出春季高于夏季的趨勢，兒茶素總量夏季高于春季，前人研究發現，F3H、DFR基因的表達量與不同發育階段葉片兒茶素含量變化趨勢一致[13,35]，光照條件下茶籽苗和愈傷組織中DFR基因表達量上調[36-37]，這體現了類黃酮生物合成的復雜性。PAL、C4H可以為類黃酮生物合成途徑提供碳通量，在兒茶素類生物合成和苯丙烷與類黃酮途徑之間的串聯中起關鍵作用，研究表明PAL、C4H基因表達與兒茶素類含量之間存在正相關[8]。本研究的相關性分析結果表明PAL、C4H、DFR表達量與兒茶素類含量之間不存在相關性，這可能是由于同源基因的存在，特定基因的表達并不一定意味著與兒茶素類含量的關系[23]。馬春雷[38]研究結果表明不同茶樹品種LAR基因表達量隨兒茶素類含量的增加而增加，本研究結果也表明LAR與兒茶素總量存在正相關關系。

兒茶素不僅是茶葉中主要的澀味物質，且具有抗氧化、預防癌癥、預防心血管疾病、調劑脂質代謝等保健功效[28,39-40]。不同季節茶樹基因表達差異分析為了解兒茶素的合成調控機制打下了基礎，但還無法解釋其分子機制，目前酯型兒茶素的生物合成途徑中沒食子?；霓D移尚未明確[41]，探究兒茶素類分子調控機理對改善茶葉品質，發揮其生理作用有重要意義。

4 結 論

茶樹兒茶素類生物合成基因春夏季的表達量存在差異，福鼎大白茶、碧香早、櫧葉齊F3H、DFR基因的表達量有春季高于夏季的趨勢；根據兒茶素類含量與生物合成基因相對表達量的結果推測， F3′5′H可能是EGCG合成的關鍵酶。