基于非靶向代謝組學分析釀酒酵母甲酸脅迫的響應和耐受性機制

曾令杰，豐丕雪，黃錦翔，梁大呈，佀再勇，龍秀鋒，伍時華，易 弋

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

燃料乙醇代替傳統化石燃料可帶來許多環境和社會效益[1]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為常用的乙醇生產者具有許多優勢，例如生長周期短、發酵能力強以及對木質纖維素水解產物中存在的乙醇[2]有更高的抵抗力，包括滲透壓[3]和弱酸[4]等。然而，在木質纖維素原料預處理和水解過程中會產生對細胞有毒的化合物，根據這些有毒化合物的來源分為弱酸、呋喃衍生物和酚類化合物3 大類[5-6]，這些毒素能抑制細胞生長，并對發酵微生物的性能產生負面影響[7-8]。因此，研究酵母細胞對木質纖維素水解液中各種脅迫環境的耐受性很重要。甲酸、乙酸和乙酰丙酸是木質素纖維素水解液中一些常見的弱酸類抑制劑[9]，在這些幾種弱酸中，雖然甲酸含量較乙酸和乙酰丙酸低，通常約為乙酸（10～20 g/L）的1/10，但其對酵母細胞的毒性最強[10-11]。因此，研究甲酸對酵母細胞的毒性機理及其解毒機制非常重要。

近年來，關于釀酒酵母對各種應激的研究越來越多，對酵母細胞應激反應的分子機制有了更好的認識[12-14]。 代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后發展起來的一門新學科[15]。Nugroho等[16]采用代謝組學方法研究乳酸誘導的脅迫對酵母代謝物庫的影響，結果表明，外源添加脯氨酸能夠抵抗乳酸誘導的氧化損傷，提高細胞的生長速率，保護細胞免受酸脅迫。Devantier等[17]通過代謝組學研究乙醇對釀酒酵母細胞代謝的影響，結果發現酵母細胞能量消耗增加，細胞內丙酮酸和相關代謝產物的含量明顯提高。Jung等[18]利用代謝組學研究探討釀酒酵母對糠醛的響應，發現釀酒酵母進行全局代謝分配以快速抵御脅迫，與能量產生、輔因子再生和細胞損傷恢復相關的代謝產物在胞內大量積累。因此，研究釀酒酵母細胞的環境脅迫耐受性具有重要意義。本實驗采用非靶向代謝組學分析，從代謝水平系統分析釀酒酵母對甲酸抑制劑的耐受機理，以期為酵母耐性調節機制的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（S. cerevisiaeGGSF16）由廣西科技大學微生物研究室保存；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基（酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L）、發酵培養基（酵母粉 10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖100 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌20 min）由實驗室自制。

甲酸（分析純） 西隴科學股份有限公司； 甲酸、甲醇、乙腈、2-丙醇（均為色譜純） 美國Fisher Chemical公司。

1.2 儀器與設備

Triple TOF 5600三重四極桿質譜、ExionLC AD液相色譜系統 美國AB SCIEX公司；HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm） 美國Waters公司；JXDC-20氮氣吹掃儀 上海凈信實業發展有限公司；LNG-T88臺式快速離心濃縮干燥器 太倉市華美生化儀器廠；Wonbio-96c高通量組織破碎儀 上海萬柏生物科技有限公司；Centrifuge 5430R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；AR224CN電子天平 奧豪斯儀器（常州） 有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甲酸脅迫對酵母細胞生長的影響

根據本課題組研究[19]的初步篩選結果，確定甲酸對釀酒酵母半致死質量濃度為1.8 g/L。以10%接種量將活化的酵母細胞接種到200 mL發酵培養基中，在30 ℃、 150 r/min搖床中培養6 h至對數生長中后期，此時菌液濃度約為3.68×107CFU/mL。以添加終質量濃度1.8 g/L甲酸溶液的菌液為處理組，未添加甲酸為對照組，在搖床中繼續培養，每隔2 h取樣用紫外分光光度計在600 nm波長處測定培養液光密度OD600nm，設置3 次生物學重復。

1.3.2 甲酸對酵母細胞發酵能力的影響

采用二氧化碳失重法[20]，以10%接種量將酵母細胞懸液接入到200 mL發酵培養基中，分別吸取一定體積40 g/L甲酸母液于培養基中，使甲酸終質量濃度分別為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L，以未添加甲酸為對照組，30 ℃、150 r/min搖床中進行培養。在發酵過程中稱量發酵瓶質量（精確到0.01 g），稱前需搖晃發酵瓶，趕除二氧化碳。計算各取樣時間點發酵瓶質量差值，即為二氧化碳釋放量。設置3 次生物學重復。

1.3.3 胞內代謝物的制備和提取

將活化的菌種接種于新鮮YPD培養基中，30 ℃、150 r/min搖床培養至對數生長中期，加入終質量濃度1.8 g/L的甲酸溶液，繼續培養2 h。取發酵液3 mL，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液，用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，再于12 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄去上清液，得到新鮮菌體于離心管中，-80 ℃處理10 min。取50 mg固體酵母至2 mL加厚離心管中，加入800 μL提取液（甲醇-水（4∶1，V/V）），加入20 μL內標溶液（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL，乙腈配制），冷凍組織研磨儀（-10 ℃、50 Hz）研磨6 min，低溫超聲（5 ℃、40 Hz）提取30 min，然后放入-20 ℃冰箱中，靜置30 min后13 000 r/mim、4 ℃離心15 min，移取上清液至帶內插管的進樣瓶中待測。實驗設置6個生物學重復。

1.3.4 液相色譜-質譜分析

采用UHPLC-Q Exactive系統。液相色譜條件：HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A為體積分數0.1%甲酸-水溶液，流動相B為含體積分數0.1%甲酸的乙腈-異丙醇（1∶1，V/V），流速 0.40 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

質譜條件：信號采集采用正負離子掃描模式，質量掃描范圍m/z70～1 050；電噴霧電離源，正離子電壓3 500 V，負離子電壓2 800 V，鞘氣壓力40 psi，輔助加熱氣壓力10 psi，離子源加熱溫度400 ℃，循環碰撞能20～60 eV。

1.3.5 差異代謝物分析

采用有監督的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型區分各組間代謝特性的總體差異，其中以變量投影重要性（variable importance projection，VIP）大于1和P值小于0.05為標準篩選差異代謝物，并通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫（https://www.kegg.jpkeggpathway.html）進行代謝通路注釋，獲得差異代謝物參與的通路。使用R軟件包ropls（Version1.6.2）進行主成分分析（principal component analysis，PCA），Python軟件包scipy.stats進行通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 甲酸對酵母細胞生長的影響

由圖1可知，對照組在6 h進入對數生長中期，8 h進入穩定期；培養6 h添加1.8 g/L甲酸后，處理組酵母細胞的生長立即受到抑制，酵母細胞生長緩慢，可能在適應新的環境。而隨著培養時間的延長，酵母細胞緩慢生長，最終細胞生長量明顯低于對照組。這說明甲酸對酵母細胞的生長繁殖具有一定的抑制作用。

圖1 甲酸對酵母細胞生長的影響Fig. 1 Effect of formic acid on the growth of yeast cells

2.2 甲酸對酵母細胞發酵能力的影響

釀酒酵母在乙醇發酵過程中會產生大量CO2，CO2釋放量可以直接指示酵母發酵時間和發酵活力，是評價釀酒酵母發酵能力最簡便快速的方法[21]。由圖2可知，不同質量濃度甲酸均影響了釀酒酵母CO2釋放特性，且存在明顯的濃度依賴效應。對照組在培養8 h CO2釋放量達到最大；添加1.0、1.2 g/L和1.4 g/L甲酸處理組的CO2釋放量也在8 h達到最大，但釋放量均低于對照組；添加1.6 g/L甲酸處理組的CO2最大釋放量出現在10 h，較對照組延長了2 h；添加1.8 g/L甲酸處理組的CO2最大釋放量出現在12 h，較對照組延長了4 h，說明1.8 g/L甲酸對酵母細胞的發酵能力具有一定的抑制作用。添加2.0 g/L甲酸處理CO2釋放量不到0.1 g，說明高質量濃度甲酸對酵母細胞具有強烈的毒害作用。

圖2 甲酸質量濃度對酵母細胞發酵能力的影響Fig. 2 Effects different concentrations of formic acid on carbon dioxide release during yeast fermentation

2.3 代謝組學的數據質控

質控工作是進行基于質譜技術的代謝組學研究時獲得可靠且高質量數據的基礎[22]。采用PCA對數據進行質控分析，可用于發現異常樣本、評價質控重復性。圖3A、B分別為正、負離子模式下質控樣本的PCA得分圖，質控樣本檢測結果較為密集的聚在一起，說明質控重復性良好，分析系統穩定，所采集的樣品數據可作進一步差異分析。

圖3 質控樣本PCA的得分圖Fig. 3 PCA score plots of quality control samples

2.4 代謝組學的PCA結果

為判別對照組和1.8 g/L甲酸處理組之間是否具有差異，本研究采用PCA建模方法對兩組進行分析。PCA結果表明，在正離子模式下PC1貢獻率為53.10%，PC2貢獻率為16.00%，兩者累計貢獻率達到69.1%。負離子模式下PC1貢獻率為61.10%，PC2貢獻率為14.10%，兩者累計貢獻率達到75.2%。如圖3所示，兩組樣品基本都處于95%置信區間內，處理組和對照組6個重復數據點檢測結果基本都能很好地集中在一起，說明在整個實驗過程中實驗操作、儀器分析穩定，數據重復性較好，可用于后續分析。

2.5 代謝組學的OPLS-DA結果

不同于PCA，OPLS-DA是一種有監督的學習方法，能很好地分離樣品且更利于尋找差異代謝物。由圖4可知，兩組樣本都能聚成一類，且區分明顯，說明該實驗重復性好，結果與PCA結果類似。此外，在正離子模式下，R2X=0.79，R2Y=0.999，Q2=0.997，負離子模式下，R2X=0.846，R2Y=0.999，Q2=0.998，這3個指標都接 近于1，表明OPLS-DA模型穩定可靠，且能較好地預測對照組和處理組酵母細胞內差異代謝物。為防止OPLS-DA 模型的過度擬合，采用置換檢驗法對OPLS-DA模型進行驗證，結果表明，根據正、負離子模式數據建立的 OPLS-DA模型未發生過擬合。

圖4 不同組代謝物的OPLS-DA得分圖（A）和置換檢驗圖（B）Fig. 4 OPLS-DA score plots (A) and permutation test charts (B) of differential metabolites

2.6 差異代謝物篩選

采用OPLS-DA模型的VIP＞1、P＜0.05為篩選標準，初步篩選出兩組的差異代謝物，共檢測出差異代謝物226種，其中有123種代謝物顯著上調，103種代謝物顯著下調，表1為甲酸處理后酵母細胞內部分差異代謝物。

表1 甲酸處理后酵母細胞內部分差異代謝物Table 1 Differential metabolites in yeast cells treated with formic acid

續表1

2.7 差異代謝物KEGG通路富集分析

通過KEGG分析發現這些差異代謝物共富集到45 條通路，共涉及55種代謝物，其中顯著富集的代謝通路有18 條。如圖5所示，有7 條氨基酸代謝通路受到顯著富集，且覆蓋差異代謝物最多的3 條氨基酸代謝通路分別為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，色氨酸代謝以及β-丙氨酸代謝通路；其余顯著富集的通路分別為泛酸和CoA生物合成，氨酰基tRNA的生物合成，碳青霉烯生物合成，嘌呤代謝，ATP結合盒蛋白轉運，嘧啶代謝，乙醛酸和二羧酸的代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，谷胱甘肽代謝，氧化磷酸化，氰氨基酸代謝，氮素代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，甘油磷脂代謝和精氨酸生物合成代謝通路。KEGG通路富集表明甲酸脅迫引發了酵母細胞的代謝紊亂，特別是氨基酸代謝和核苷酸代謝受到影響最大，這些代謝通路可能在釀酒酵母耐受甲酸脅迫的研究中有重要意義。

圖5 差異代謝物KEGG富集通路圖Fig. 5 KEGG enrichment pathways of differential metabolites

2.8 代謝通路分析

將拓撲分析和富集分析結合，進一步判斷某一代謝通路是否在所研究的生物學過程中起到關鍵作用。對甲酸處理組和對照組之間有顯著差異的代謝產物進行途徑富集和拓撲分析，從而識別出甲酸對酵母細胞代謝通路的潛在影響，結果如表2和圖6所示。圖6中每一個氣泡表示一種KEGG通路，氣泡大小代表重要性，氣泡越大，表示代謝物在通路中的重要性越大。在甲酸的影響下共鑒定出43 條代謝途徑，重要性得分排名前20的代謝通路中，重要性值大于0.1的潛在代謝通路有9 條，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，泛酸和CoA生物合成，嘧啶代謝，色氨酸代謝，組氨酸代謝，酮體的合成與降解，脂肪酸降解，糖酵解/糖異生以及賴氨酸的生物合成。

表2 重要性排名前20的代謝通路Table 2 Top 20 most important metabolic pathways

圖6 顯著差異代謝物代謝通路分析Fig. 6 Metabolic pathway analysis of significantly differential metabolites

2.9 甲酸脅迫下酵母代謝物差異的分析

通過基于液相色譜-質譜的代謝組學方法，在處理組與對照組間共檢測出226種差異代謝物，其中123種差異代謝物上調，113種差異代謝物下調，通過代謝通路分析發現差異表達的代謝物主要與氨基酸代謝和核苷酸代謝相關。

氨基酸是許多細胞生物合成和代謝過程中的主要代謝產物，在細胞中通常作為前體物質參與細胞的構建，還可以通過形成催化酶調節細胞代謝。如圖7A和圖8所示，涉及氨基酸代謝的差異代謝物中，與對照組相比，處理組中氧化型谷胱甘肽、半胱氨酰甘氨酸、檸檬酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、黃嘌呤酸、2,3-吡啶二羧酸、奎寧酸、5-氨基乙酰丙酸、D-4′-磷酸泛酸、D-甘油-2-磷酸酯等顯著下調，而吲哚乙醛、5-羥基吲哚乙酸、L-谷氨酰胺、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、N-乙酰天門冬氨酸等則顯著上調。

圖7 甲酸處理后酵母細胞內顯著差異代謝物含量聚類圖Fig. 7 Cluster analysis of significantly differential metabolite contents in yeast cells after formic acid treatment

圖8 甲酸處理后酵母細胞內顯著差異代謝物含量箱形圖Fig. 8 Box plot of significantly differential metabolite contents in yeast cells after formic acid treatment

代謝組分析表明，在甲酸脅迫下酵母細胞內氧化型谷胱甘肽、半胱氨酰甘氨酸、L-谷氨酸以及檸檬酸的水平明顯降低。有研究表明，谷胱甘肽能夠還原活性氧自由基，生成氧化型谷胱甘肽以發揮抗氧化功能，調節細胞內的氧化還原狀態，并作為對抗活性氧的保護 劑[23-24]。此外，L-谷氨酸和半胱氨酸也能作為活性氧清除劑對抗氧化應激[25-26]。有研究報道，半胱氨酸的添加可以促進谷胱甘肽的合成[27-28]，甘氨酸也直接參與谷胱甘肽的合成[29]。本研究中，在甲酸影響下，處理組氧化型谷胱甘肽和半胱氨酰甘氨酸含量較對照組顯著下降，推測甲酸脅迫導致酵母細胞內活性氧積累，擾亂細胞氧化還原平衡，產生氧化應激反應，酵母細胞為維持細胞正常生長大量消耗谷胱甘肽，以抵御活性氧，從而避免細胞受到損傷。Jozefczuk等[30]研究發現，高溫、低溫等環境脅迫會導致碳中心代謝相關物質含量的下降，這是細胞在抵抗脅迫下為降低能量消耗所采取的自我保護。而本研究中，在甲酸影響下，三羧酸循環中間產物檸檬酸的含量較對照組明顯降低，這也是酵母細胞采取保存能量的措施實現自我保護。此外，參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的中間體L-谷氨酸水平在甲酸脅迫下顯著下調，這可能是由于三羧酸循環的抑制間接導致L-谷氨酸的減少。在谷氨酸脫氫酶作用下三羧酸循環中的α-酮戊二酸可轉化為谷氨酸，同時還可以使L-谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸，并生成還原型輔酶II和ATP。因此，推測酵母細胞可能通過L-谷氨酸分解代謝提供能量和還原力抵抗甲酸誘導的氧化應激，從而導致L-谷氨酸的含量降低。在氨酰基tRNA的生物合成途徑中，用于tRNA連接的L-氨基酸含量普遍下降。氨酰基tRNA合成途徑在蛋白質合成中具有至關重要的作用，可能與細胞生長代謝調節密切相關。Weber等[31]研究發現在環境脅迫條件下，為降低能量損耗實現自我保護，與細胞生長、分裂以及蛋白合成相關的基因受到抑制。Dong Yachen等[32]也發現，釀酒酵母在醋酸脅迫下其與氨基酸生物合成相關的代謝物水平均明顯下調，從而保護細胞免受醋酸損傷。由此猜測，甲酸脅迫可引起酵母細胞內營養物質氨基酸匱乏，使得氨酰基tRNA生物合成底物不足，蛋白質生物合成受阻，細胞生長受到抑制，而酵母細胞通過下調氨基酸代謝通路降低能量需求，維持碳氮代謝平衡，使其在逆境中得以存活。

此外，氨基酸的積累有利于細胞抵抗低溫、高溫和氧化脅迫[29]。代謝組分析表明，甲酸脅迫下酵母細胞中色氨酸代謝通路發生顯著改變，通路中吲哚乙醛、5-羥基吲哚乙酸、L-色氨酸代謝產物全部呈上調趨勢，而黃嘌呤酸、2,3-吡啶二甲酸含量呈下調趨勢，表明色氨酸代謝通路在甲酸脅迫過程中發揮重要作用。此外，處理組芳香族氨基酸L-苯丙氨酸水平較對照組也顯著上調。有研究表明，在色氨酸生物合成途徑突變體中，通過向培養基中添加高水平色氨酸，或者過表達Tat2p高親和力的色氨酸通透酶來抑制這種弱酸超敏性[33]。Ding Mingzhu等[34]研究表明氨基酸的積累能提高細胞的耐受性主要是因為氨基酸能穩定細胞膜結構。此外，還可能是由于甲酸脅迫導致酵母細胞內不正常的蛋白質合成增加，細胞需要自我調節以增加對這些不正常蛋白質的降解[35]。有研究表明，芳香族氨基酸可以通過形成疏水區域保護蛋白質免受膽汁脅迫[36]，游離芳香族氨基酸（色氨酸和苯丙氨酸）可能通過減少汞誘導的活性氧產生促進植物對汞脅迫的反應[37]。因此推測，甲酸脅迫也可能通過積累活性氧誘導氧化應激，芳香族氨基酸通過形成疏水區域并減少活性氧的產生協助抵抗甲酸脅迫，從而提高甲酸的耐受性，但是具體機制尚待進一步探索。

核苷酸是細胞生長和繁殖所必需的基本物質，它不僅可以作為DNA和RNA合成的前體，而且在代謝中也扮演著重要角色，可作為生理、生化過程的調節物質參與體內物質代謝[38]。核苷酸代謝與氨基酸代謝有著密切的聯系，共有代謝物有5′-磷酸核糖焦磷酸、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸、四氫葉酸等，甲酸影響氨基酸代謝，必然也會影響細胞內核苷酸代謝。代謝組分析表明，在甲酸脅迫下酵母細胞內嘌呤代謝和嘧啶代謝相關的代謝物受到嚴重抑制，其含量普遍較對照組顯著降低。如圖7B和圖8所示，鳥苷、肌苷、腺苷琥珀酸酯、腺苷琥珀酸、黃嘌呤、尿嘧啶、尿苷、胞苷-5′-磷酸、DTMP等水平顯著下調，而谷氨酰胺和5′-磷酸核糖基-N-甲酰甘氨酰胺水平顯著上調。

嘌呤和嘧啶是細胞內核苷酸代謝的重要組成部分，同時核苷酸的合成大多數都需要耗能，如嘌呤代謝的從頭合成途徑中合成1 分子次黃嘌呤核苷酸需要消耗5 分子ATP和6個高能磷酸鍵，合成AMP或GMP又需要消耗1 分子ATP。鳥苷、肌苷、腺苷琥珀酸酯、腺苷琥珀酸、黃嘌呤水平較對照組顯著下調，表明這些物質參與嘌呤代謝的補救途徑；參與嘧啶代謝的尿嘧啶、尿苷、胞苷-5′-磷酸、DTMP水平也有所下調，這些代謝物的合成過程也需要消耗能量，而甲酸的存在造成胞內ATP生成受損及消耗增加，可見酵母細胞選擇減少核苷酸代謝的生物合成，降低能量消耗來提高對甲酸的耐受性。此外，參與核苷酸合成途徑的相關代謝物水平普遍下調，也可能是由于甲酸抑制了酵母細胞DNA的生物合成，進而影響了細胞的正常生長。

添加甲酸后酵母細胞內L-谷氨酰胺和5′-磷酸核糖基-N-甲酰甘氨酰胺含量急劇增加。已有研究報道，L-谷氨酰胺在氮的分解代謝和合成代謝過程中扮演重要角色，同時它也是細胞內氮的主要來源[39-40]。另外，谷氨酰胺也是其他氨基酸和核苷酸生物合成的前體物質[41]。因此推測，酵母細胞可能會通過合成更多的前體物質保護細胞免受甲酸脅迫。5′-磷酸核糖基-N-甲酰甘氨酰是一種非常弱的堿性化合物，主要以磷酸核糖甲酰基甘氨酰胺合酶的底物，作為嘌呤核苷酸從頭合成過程中的中間產物，由甘氨酸參入5′-磷酸核糖胺而形成，在嘌呤代謝以及谷氨酰胺向谷氨酸的轉化中具有重要作用。這兩種物質在酵母細胞內積累可能也有助于提高細胞耐受性，但是具體機理還需要后期進一步驗證。

3 結 論

通過基于液相色譜-質譜聯用的非靶向代謝組學技術研究釀酒酵母響應甲酸脅迫的代謝機制。研究結果表明，氨基酸，尤其是L-色氨酸、L-苯丙氨酸、谷氨酰胺、5-羥基吲哚乙酸、吲哚乙醛，以及核苷酸等代謝物在甲酸脅迫過程中發生顯著改變，可能在釀酒酵母應對甲酸脅迫過程中起關鍵作用。甲酸脅迫可能導致酵母細胞內活性氧過度積累，誘導氧化應激，擾亂酵母細胞的能量代謝和氧化還原平衡狀態，導致酵母細胞內ATP合成受損及消耗增加，同時致使細胞內氨基酸匱乏，氨酰基tRNA生物合成的底物不足，進一步抑制蛋白質的生物合成，影響細胞正常生長，使其存活率下降。胞內芳香族氨基酸水平的上調以及部分氨基酸和核苷酸的合成代謝減慢可以降低能量的消耗，實現自我保護，從而有助于提高酵母細胞對甲酸的耐受性。本研究初步揭示了釀酒酵母響應甲酸脅迫的分子機制，后期將進一步驗證差異代謝物在甲酸脅迫過程中的作用。