基于電子舌檢測快速判別不同物種畜禽骨蛋白肽

劉 泓，郭玉杰,*，陳永凱，李 俠，張鴻儒，韓 東，張春暉,*，姜 珊

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，農業農村部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193；2.內蒙古阿榮旗牧源康肽實業有限公司，內蒙古 呼倫貝爾 162750）

中國是畜禽肉類生產和消費大國，每年產生約 1 700萬 t的畜禽骨，居世界首位[1]。畜禽骨中富含蛋白（主要為骨膠原蛋白）、多糖、礦物質等多種營養組分[2]，是生產功能性骨源食品的重要原料。研究表明，骨膠原蛋白經酶解產生的功能多肽具有抗氧化[3]、 抗菌[4]、血管緊張素轉換酶抑制性[5]、抗阿爾茨海 默癥[6]、呈味[7]、免疫調節[8]、促成骨細胞增殖[9-12]、改善關節炎[13-14]、增強骨密度及抗骨質疏松[15-17]等多種生理活性。Kolodziejska等[18]的研究表明畜禽骨膠原蛋白肽可顯著提高骨密度、刺激軟骨細胞合成II型膠原以增加骨骼的穩固性，對骨質疏松、骨關節炎等疾病有潛在的改善和治療作用。Guillerminet等[19]發現牛、豬、魚骨膠原蛋白肽對成骨細胞的增殖及分化效果顯著。Elam等[20]發現骨膠原蛋白肽可顯著改善絕經后女性的骨量流失。膠原蛋白及其多肽在食品、藥品、化妝品、藥物輸送及骨組織工程等行業中的應用日益廣泛，2018年全球膠原蛋白市場規模約為42.7億 美元，預計在2025年將達66.3億 美元，開發高附加值功能型產品的潛力巨大[21]。2015—2019年全球共發布了3 200多種膠原蛋白肽運動營養型食品[22]，我國豐富的畜禽骨資源使畜禽骨蛋白及其多肽的市場前景廣闊，需求規模不斷擴大[23]。

目前用于生產畜禽骨蛋白肽的原料骨主要有牛骨、豬骨、雞骨等畜禽骨[24]。畜禽骨原料差異與骨蛋白肽的功能活性密切相關，不同物種畜禽骨原料價格差異亦較大，這直接決定了骨蛋白肽產品生產成本的不同[25]，導致畜禽骨蛋白肽市場存在以次充好銷售等問題，侵害消費者的經濟權益及身心健康。因此，有必要建立一種針對不同物種畜禽骨蛋白肽進行定性判別鑒定的快速有效的分析方法。目前，用于食品定性判別的方法包括：感官檢驗法、品質相關理化指標的化學分析法、基于蛋白質的分析方法（免疫分析、色譜分析法、質譜分析法、紅外光譜法等）、基于核酸的分析方法（分子標記分析、實時聚合酶鏈式反應等）[26]，但均存在檢測耗時長、判別效果差、樣品預處理繁雜、人員需要特殊訓練等問題，并不適用于畜禽骨蛋白肽的檢測判別。

電子舌是近年發展起來的由交互敏感傳感器陣列、信號調整電路以及自帶的模式識別算法軟件構成的一種新型味覺分析檢測儀器[27]，通過模擬人體5種基本味感（酸、甜、苦、咸、鮮）將食品液體的滋味特征轉化為電信號響應值經分析將滋味特征量化[28]，具有客觀性強、穩定性好、工作效率高、檢測閾低的優點[29]，便于實時檢測、快速分析[30]。本實驗基于不同畜禽骨原料生產的骨蛋白肽的味覺特征差異，探究利用電子舌快速判別鑒定不同物種畜禽骨蛋白肽的可行性，以期為畜禽骨蛋白肽摻雜摻假檢測研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛骨蛋白肽（yak bone peptides，YBPs） 內蒙古自治區呼倫貝爾市阿榮旗牧源康肽生物科技有限公司； 黃牛骨蛋白肽（bovine bone peptides，BBPs） 山東海鈺生物股份有限公司；豬骨蛋白肽（pig bone peptides，PBPs） 北京太愛肽生物工程技術有限公司；雞骨蛋白肽（chicken bone peptides，CBPs） 浙江輝肽生命健康科技有限公司。每個物種畜禽骨蛋白肽包含4 份種內樣本，成品均為干燥粉末狀，將4 份種內樣本均勻混合用于電子舌分析檢測。

氫氧化鈉、鹽酸、硫酸鉀、乙醇（體積分數95%）、石油醚（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；氨基酸混合標準溶液（色譜級） 美國Sigma-Aldrich公司；石英砂、脫脂棉、濾紙等。

1.2 儀器與設備

BD(E2)型熱風循環箱 德國Binder儀器公司； ZK-GQ18-17TP型馬弗爐 北京中科北儀科技有限公司；N310型免水全自動凱氏定氮儀 廣州格丹納儀器有限公司；Soxtec 8000型自動索氏抽提器 丹麥Foss公司；Allegra X-12型臺式高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；L-8800型氨基酸自動分析儀 日本日立 公司；α-Astree電子舌 法國Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 畜禽骨蛋白肽基本營養組分的測定

水分含量測定：參照GB 5009.3—2016《食品中水分含量的測定》；灰分含量測定：參照GB 5009.4—2016《食品中灰分含量的測定》；粗蛋白含量測定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質含量的測定》，由于畜禽骨蛋白中主要為膠原蛋白，粗蛋白含量的蛋白換算系數為5.79；粗脂肪含量測定：參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪含量的測定》。每份樣本測定3 次，每種畜禽骨蛋白肽的4 份種內樣本取平均值。

1.3.2 畜禽骨蛋白肽氨基酸組成分析

取65～70 mg畜禽骨蛋白肽粉（精確到0.1 mg）及20 mL 6 mol/L HCl溶液，加入水解管中，密封，105 ℃水解20 h后將溶液過濾，超純水定容至100 mL容量瓶中。取1 mL溶液氮吹，然后用0.5 mol/L HCl溶液稀釋10 倍后用0.22 μm水相濾膜過濾，取1 mL裝入進樣瓶待全自動氨基酸分析儀檢測。每份樣本測定3 次，每種畜禽骨蛋白肽的4 份種內樣本取平均值。

1.3.3 畜禽骨蛋白肽溶液制備

準確稱取10 g畜禽骨蛋白肽粉溶解于100 mL熱的超純水中，4 ℃、4 000 r/min離心20 min，先后用紗布過濾及普通濾紙抽濾，最后用0.45 μm濾膜砂芯抽濾，取濾液備用。

1.3.4 電子舌檢測

采用電子舌檢測系統，包含由7 根味覺傳感器組成的交叉敏感電位傳感器陣列、Ag/AgCl參比電極[31]、機械攪拌器、16 位自動進樣器以及數據采集分析系統。表1列出了7種傳感器的性能，傳感器的分子膜可選擇性吸附不同的滋味物質，將滋味特征轉化為電信號數據[32]。電子舌經過活化和校準后，取80 mL畜禽骨蛋白肽溶液按順序加入125 mL檢測杯中。單次采樣時間120 s，樣品間采用超純水清洗10 s，采集周期為1 次/s，攪拌速率3 r/s，室溫下采集數據。每份畜禽骨蛋白肽樣品重復檢測7 次[33]，不區分畜禽骨蛋白肽種內樣本來源，將4 份種內樣本均勻混合用于畜禽骨蛋白肽種間樣本的檢測判別。4種畜禽骨蛋白肽一共產生28 組滋味數據以進行滋味特征分析。

表1 α-Astree電子舌化學選擇性區域效應傳感器性能描述Table 1 Performance descriptions of chemically sensitive field-effect transistor sensors employed in α-Astree electronic tongue

1.4 數據分析

畜禽骨蛋白肽基本營養組分含量及氨基酸組成使用SPSS 25.0軟件進行Duncan方差分析：P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。畜禽骨蛋白肽溶液滋味檢測數據由電子舌軟件系統進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和判別因子分析（discriminant factor analysis，DFA），使用SIMCA 14.1軟件進行偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）[34]。從28 組數據中隨機選取12 組作為訓練集，其余16 組均為測試集，利用SPSS 25.0建立Fisher判別函數模型[28]。結果以±s表示，采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 畜禽骨蛋白肽營養組分分析

2.1.1 畜禽骨蛋白肽基本營養組分分析

如表2所示，畜禽骨蛋白肽主要成分為水分、灰分、粗蛋白等。水分質量分數在4%～6%之間，CBPs水分含量最高。CBPs粗蛋白含量最少，且與其余3種畜禽骨蛋白肽差異顯著（P＜0.05）。脂肪含量雖是影響畜禽骨蛋白肽整體口感的重要因素，但含量均極少。CBPs灰分含量最高，且與其余3種畜禽骨蛋白肽差異顯著 （P＜0.05）。畜禽骨蛋白肽中多肽含量高，而水分和灰分含量較少且對呈味沒有直接影響，因而畜禽骨蛋白肽滋味差異的主要物質基礎可能為蛋白質、多肽以及游離氨基酸組成及含量[35]。

表2 4種畜禽骨蛋白肽的基本營養成分分析Table 2 Nutrient components of bone peptides from different animal species%

2.1.2 畜禽骨蛋白肽氨基酸組成分析

氨基酸參與多種生理活動，是維持機體正常代謝的必需營養物質之一，同時也是一種重要的滋味成分，可通過α-NH+和γ-COO-基團之間的靜電吸引形成五元環結構而呈味[36]，氨基酸之間以及氨基酸與肌苷酸等其他成分之間還存在相互協同作用，按呈味特征將游離氨基酸分為鮮味、甜味、苦味3 組。

如表3所示，畜禽骨蛋白肽中檢出17種氨基酸，色氨酸因酸性條件受到破壞、谷氨酰胺及天冬酰胺因脫酰胺基而未檢出。游離氨基酸總量以及鮮味、甜味、苦味氨基酸含量在4種畜禽骨蛋白肽中均具有一定差異，但整體均表現為甜味氨基酸含量最高，其次為苦味、鮮味氨基酸。各氨基酸的呈味閾值各不相同，鮮味氨基酸雖然含量最低，但其呈味閾值也較低，因而對總體滋味的增強作用通常較強。CBPs的鮮味、甜味氨基酸含量與其余3種畜禽骨蛋白肽差異較顯著（P＜0.05）。

表3 4種畜禽骨蛋白肽的中游離氨基酸組成及含量Table 3 Free amino acid composition of bone peptides from different animal species

2.2 基于電子舌檢測的畜禽骨蛋白肽滋味特征分析

2.2.1 電子舌檢測對畜禽骨蛋白肽的響應信號曲線

圖1顯示電子舌味覺傳感器對畜禽骨蛋白肽的響應強度，表明4種畜禽骨蛋白肽的滋味特征接近。味覺傳感器的響應強度均為SCS（對苦味敏感）＞ANS（對甜味敏感）＞PKS（通用傳感器）＞NMS（對鮮味敏感）＞CTS（對咸味敏感）＞CPS（通用傳感器）＞AHS（對酸味敏感）。0～5 s內傳感器響應強度發生顯著變化，10 s后趨于平衡，說明電子舌用于分析樣品滋味物質強度時具有良好的穩定性，選取每個傳感器在120 s的穩定滋味數值。

圖1 電子舌傳感器對畜禽骨蛋白肽的響應信號曲線Fig. 1 Response curves of electronic tongue sensors to bone peptides from different animal species

2.2.2 畜禽骨蛋白肽的滋味特征及差異分析

電子舌分析系統基于傳感器的響應信號強度得到4種畜禽骨蛋白肽的滋味強度，進一步分析畜禽骨蛋白肽的滋味特征以及種間滋味差異。

表4的滋味強度分析結果表明，畜禽骨蛋白肽在酸、甜、苦、咸、鮮5種基本味覺強度上均存在差異。其中，鮮味的差異相對最為明顯，這可能是由于鮮味氨基酸呈味閾值低。表5的種間滋味差異分析顯示，4種畜禽骨蛋白肽兩兩之間均具有顯著滋味差異（P＜0.01）。其中，PBPs和CBPs之間的距離和模式識別指數均最大，表明PBPs和CBPs之間滋味特征差異最大。

表4 4種畜禽骨蛋白肽的滋味強度Table 4 Evaluation of taste characteristics of bone peptides from different animal species

表5 4種畜禽骨蛋白肽滋味差異分析Table 5 Analysis of taste differences between bone peptides from different animal species

2.2.3 畜禽骨蛋白肽滋味的雷達指紋圖譜

由圖2可知，4種畜禽骨蛋白肽在SCS、NMS和PKS傳感器上的響應強度存在差異，在AHS、ANS、CTS、CPS傳感器上的響應強度無明顯差異，表明畜禽骨蛋白肽在鮮味、苦味屬性上差異較顯著，酸味、咸味、甜味差異不顯著。電子舌具備根據滋味物質差異而判別不同物種畜禽骨蛋白肽的潛力。

圖2 畜禽骨蛋白肽滋味的雷達指紋圖譜Fig. 2 Radar fingerprints of taste of one peptides from different animal species

2.3 畜禽骨蛋白肽滋味差異的多元統計分析

2.3.1 PCA

將電子舌傳感器提取的多指標數據信息進行降維轉換得到特征向量并進行線性分類，在轉換中得到的PC1和PC2的貢獻率越大，說明降維后的綜合指標可越好地反映原來多指標的信息。

圖3中每個多邊形代表一種畜禽骨蛋白肽的整體滋味特征，多邊形之間的距離代表畜禽骨蛋白肽種間的整體滋味差異。PC1和PC2的貢獻率分別為86.019%和11.266%，兩者累計貢獻率達97.285%，判別指數為64，表明PC1和PC2包含了原始數據的大多數信息，能夠反映樣品的整體信息。畜禽骨蛋白肽種間較明顯地分為互不干擾的4個區域，BBPs和PBPs之間差異相對較小。PCA結果表明，基于電子舌滋味檢測對不同物種畜禽骨蛋白肽的定性判別效果良好。

圖3 畜禽骨蛋白肽滋味的PCA圖Fig. 3 PCA plot of taste of bone peptides from different animal species

2.3.2 PLS-DA和OPLS-DA

PLS-DA是常見的數據分類方法，對數據降維并進行線性擬合建立回歸模型，而OPLS-DA是在PLS-DA的基礎上進行正交變換矯正，濾除與分類信息無關的噪音以獲得更好的組間分離效果。如圖4A1、B1所示，PLS-DA 模型的R2Y=0.847、Q2=0.524，表明模型對變量Y的解釋率為84.7%，且Q2＞0.50，說明模型擬合度較好，預測能力高；由置換檢驗結果可知，R2的截距為0.294，Q2的截距為-0.802，表明模型預測能力良好、有效可用，且不存在過擬合。變量投影重要性值（variable importance in projection，VIP）的結果（圖4C1）表明，NMS、ANS為主要差異因素（VIP＞1），即鮮味、甜味對4種畜禽骨蛋白肽判別的貢獻較大，與電子舌滋味分析的結果一致。表明PLS-DA可對CBPs、YBPs、BBPs和PBPs進行良好判別，但對于BBPs和PBPs的判別效果不理想，故對兩者進一步作OPLS-DA分析。如圖4A2、B2所示，OPLS-DA模型R2Y=0.991、Q2=0.841，表明模型對分類變量Y的解釋率為99.1%，且Q2＞0.50，說明模型的預測效果好；由置換檢驗結果可知，R2截距為0.347，Q2截距 為-0.639，表明模型的預測能力高且穩定性良好。VIP值的結果（圖4C2）顯示，NMS、CPS、ANS是BBPs和PBPs滋味差異的主要因素，即鮮味、甜味對BBPs與PBPs的判別貢獻較大。

圖4 不同物種畜禽骨蛋白肽的PLS-DA及OPLS-DA分析結果Fig. 4 PLS-DA and OPLS-DA scores of bone peptides from different animal species

以上結果表明，鮮味、甜味、苦味為不同物種畜禽骨蛋白肽的主要滋味差異，建立的PLS-DA模型可對CBPs、YBPs、BBPs和PBPs進行良好判別，OPLS-DA模型可進一步判別BBPs、PBPs，PLS-DA和OPLS-DA模型擬合效果和穩定性好、預測能力高，表明基于電子舌檢測結合多元統計分析根據滋味特征差異判別不同物種畜禽骨蛋白肽具有較好的靈敏度和穩定性。

2.3.3 Fisher判別模型

Fisher判別分析是一種用于判別樣本歸類的多元線性分析方法，是將n維向量x=（x1,x2, ···,xn）投影到m個線性函數組合y1=a1x,y2=a2x, ···,ym=amx（m＜n）進行降維，同時依據組間均方差與組內均方差之比最大的原則使不同類別離差最大而同類別離差最小，依據y1,y2, ···,ym判定樣品類別。從電子舌檢測產生的28 組數據中隨機選取12 組作為訓練集，其余16 組為測試集，建立Fisher判別模型，觀察值為AHS、PKS、CTS、NMS、CPS、SCS、ANS 7根傳感器響應值。在Fisher判別分析中，若樣本分類有f種，樣本特征指標有g個，一般需建立（f-1）個包含樣本所有g個指標的判別函數模型。本研究中畜禽骨蛋白肽樣本為4種，因此建立3個典則判別函數模型，分別記為Y1、Y2、Y3。分析得到不同物種畜禽骨蛋白肽的典則判別函數為：

根據測試集和訓練集數據的代入結果，若Y1、Y2、Y3均大于0，則屬于PBPs；若Y1＜0且Y2、Y3均大于0，則對應屬于YBPs、BBPs、CBPs。將測試集數據代入判別方程，判別結果顯示判斷正確的樣本數為11，判斷錯誤的樣本數為5，判別正確率為68.8%，這表明Fisher判別函數對4種畜禽骨蛋白肽具備一定的判別能力，但判別能力相對不顯著（一般要求判別正確率大于0.8），樣本誤判的原因可能是畜禽骨蛋白肽的整體滋味特征非常接近或實驗誤差所致。

由表6可知，3個典則判別函數的特征值分別為20.560、4.366、0.618，方差累計100%，典則相關系數分別為0.977、0.902、0.618，這與解釋方差的比例吻合。典則判別函數的特征值表示函數組間平方和與組內平方和之比，特征值越大表明函數的判別效果越好，典則相關系數則表示典則判別函數與組別間的關聯程度。可見，典則判別函數Y1的判別能力和各組間的關聯程度最高，Y2良好，而Y3則較差。Λ統計量是用于描述Fisher判別模型的有效性檢驗結果和函數的判別能力，該檢驗的原假設是認為不同組的Fisher判別函數平均值不存在顯著差異，即認為典則判別函數是無效的且判別能力不顯著。由表7可知，典則判別函數Y1在0.05的顯著性水平下拒絕原假設，即典則判別函數Y1的判別能力相對較顯著（P＜0.05），而Y2和Y3在0.05的顯著性水平下接受原假設，即典則判別函數Y2和Y3的判別能力相對不顯著（P＞0.05）。

表6 Fisher判別函數特征值Table 6 Eigenvalues of Fisher discriminant functions

表7 Fisher判別函數的Λ統計量Table 7 Λ statistics of Fisher discriminant functions

2.3.4 DFA

DFA是針對傳感器數據進行優化重組，從而使組間距離最大同時保證組內差異最小以提高樣品間區分度的分類技術。

由圖5可知，DF1和DF2的貢獻率分別為75.100%和23.883%，累計貢獻率達98.983%，前2個主成分包含了原始數據的絕大部分信息。4種畜禽骨蛋白肽樣本組內分布集中、離散度小，樣本組間分布距離遠、離散度大。表明電子舌檢測結合DFA對4種畜禽骨蛋白肽樣本的判別效果好、靈敏度高。

圖5 畜禽骨蛋白肽滋味的DFA圖Fig. 5 DFA plot of taste of bone peptides from different animal species

2.4 電子舌檢測結合多元統計分析的應用及比較

電子舌檢測結合PCA、DFA、PLS-DA、OPLS-DA、Fisher判別分析等多元統計分析方法，可量化滋味特征差異，良好判別4種畜禽骨蛋白肽，且DFA判別能力更顯著。PCA是無監督的分類技術，通過正交變換旋轉數軸將一組可能存在相關性的變量降維轉換為一組線性不相關的變量，而后進行線性分類得到一組新的數軸以捕捉數據集間的最大差異。而DFA需要先驗知識以優化重組數據的區分性，使得組間數據重心距離最大的同時保證組內差異最小，因此其判別效果一般優于PCA。PLS-DA通過將自變量和因變量數據集之間的協方差最大化來構建正交得分向量，同時擬合自變量和因變量數據之間的線性關系建立回歸模型，然后利用一定的判別閾值對回歸結果進行判別分析，從而較PCA能更高效地提取組間變異信息。OPLS-DA則是在PLS-DA的基礎上使用正交變換矯正將X矩陣信息分解成與Y相關和不相關的兩類信息，然后濾除與分類無關的信息并將相關的信息主要集中在第1個預測成分，更適用于分析兩組間的變異信息，OPLS-DA能夠保持模型預測能力，有效減少模型的復雜性和增強模型的解析能力，因此更能體現與實驗條件有關的樣品差異，相較于PCA和PLS-DA能使組間樣本的分離效果更佳。

總之，本研究結果表明，電子舌滋味檢測結合多元統計分析根據滋味特征差異能夠有效判別不同物種畜禽骨蛋白肽，且DFA模型的判別效果最佳。

3 結 論

電子舌檢測簡便高效、重復性好，是一種很有前景的味覺分析手段[37]。本研究以16 份畜禽骨蛋白肽為原料，電子舌采集滋味特征數值，結合PCA、PLS-DA、OPLS-DA、DFA等多元統計分析方法對不同物種畜禽骨蛋白肽的滋味特征進行判別分析，同時初步構建了Fisher判別模型以判別鑒定不同物種畜禽骨蛋白肽，探究基于電子舌滋味特征檢測判別不同物種畜禽骨蛋白肽的可行性。結果表明，通過PCA和DFA均可良好的判別4種畜禽骨蛋白肽，但DFA明顯優于PCA；PLS-DA可有效判別CBPs、YBPs、BBPs和PBPs，OPLS-DA可有效判別BBPs、PBPs。建立的Fisher判別分析模型可有效判別PBPs和YBPs、BBPs、CBPs，但對后三者的判別效果不夠理想，模型判別的正確率為68.8%。鮮味、甜味、苦味是4種畜禽骨蛋白肽的主要差異滋味特征。綜上，電子舌滋味檢測結合多元統計分析能夠為不同物種畜禽骨蛋白肽的判別鑒定提供了一種快速、有效的分析檢測手段。