食管鱗癌原位模型小鼠腸道菌群分析

張玉雙，于富洋，吳忠冰，王一然，李晶，*

本研究背景：

已有研究表明腸道菌群與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療密切相關，尤其在結直腸癌、肝癌方面的研究較多。食管癌是我國的高發(fā)腫瘤，其發(fā)病率與死亡率均為世界平均水平的2 倍以上。我國以食管鱗癌為主，早期行根治術后預后較好，但相當多的患者就診時已處于中晚期，失去手術機會。因此尋找簡便易取材的檢驗方法，提高食管癌早期診斷率并給予干預措施十分重要。

本研究創(chuàng)新點：

（1）高比例成功制備了食管鱗癌原位模型小鼠，模擬了食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的過程，為同類研究提供了基礎。（2）選擇飼養(yǎng)環(huán)境一致的小鼠作為研究對象，可以減少因為飲食、環(huán)境等因素對菌群研究結果造成的誤差。（3）通過初步對食管癌差異菌屬的篩選，為下一步探討機制研究提供基礎。

最新的《全球癌癥統(tǒng)計報告》數(shù)據(jù)顯示，2020 年全球食管癌新發(fā)病例數(shù)為60.4 萬例，死亡病例數(shù)為54.4 萬例，分別占全球癌癥新發(fā)、死亡總病例數(shù)的3.1%、5.5%［1］。食管癌發(fā)病風險地域差異較大，我國是食管癌發(fā)病高風險國家，據(jù)統(tǒng)計2020 年我國新發(fā)食管癌病例數(shù)為32.4 萬例，死亡病例數(shù)為30.1 萬例，分別占全球食管癌新發(fā)、死亡總病例數(shù)的53.7%、55.3%［2］。我國食管癌患者病理類型以鱗癌為主，早期行根治術后預后較好，但由于相當多的食管癌患者確診時已處于中晚期，失去了手術機會，因此提高食管癌早期診斷率仍具有十分重要的意義。

隨著高通量測序技術的應用與發(fā)展，腸道微生態(tài)研究已成為目前腫瘤領域研究的熱點之一。有研究證實腸道菌群在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，食管鱗癌患者口腔、癌組織及癌旁正常組織中菌群結構發(fā)生了改變并與食管癌的發(fā)生有關［3-4］。因腸道菌群的影響因素較多，本研究特選取飼養(yǎng)環(huán)境可控的食管鱗癌原位模型小鼠，以觀察與食管鱗癌相關的腸道菌群結構變化、篩選出特異性改變的腸道菌屬，為食管鱗癌的早期篩查提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買雌性SPF 級C57BL/6 小鼠20 只〔合格證號：SCXK（京）2016-0006〕，體質(zhì)量14～17 g，鼠齡6 周。適應性喂養(yǎng)1 周后將所有小鼠隨機分為對照組（DZ 組）和模型組（MX 組），每組10 只。所有實驗操作嚴格遵照河北醫(yī)科大學實驗動物中心指南執(zhí)行，遵守動物保護、動物倫理原則及相關規(guī)定。本實驗時間為2020 年8 月至2021 年5 月。

1.2 干預方法 DZ 組小鼠常規(guī)喂養(yǎng)32 周，全程給予普通飲用水；MX 組小鼠按照造模方法常規(guī)喂養(yǎng)并給予含0.1 mg/ml 的誘癌劑4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）飲用水喂養(yǎng)16 周，之后給予普通飲用水喂養(yǎng)至32 周。4NQO 飲用水制備方法：將誘癌劑4NQO（購自Sigma-Aldrich 公司，型號：N8141）溶解于1，2 丙二醇，配制成濃度為2%的母液并保存于-20 ℃冰箱，使用時按照0.1 mg/ml 濃度比例混入飲用水中。

1.3 糞便的無菌收集與處理 喂養(yǎng)32 周后收集兩組小鼠糞便：在籠具里面放入干凈的濾紙后將小鼠依次放入，每籠1 只；用鑷子輕輕刺激小鼠下腹和肛門，待小鼠排便后立即用凍存管進行收集；將凍存管做好標記后放入液氮中，5 min 后再將凍存管放入-80 ℃冰箱中保存。最終共收集到20 個糞便標本，每組10 個。上述操作均在滅菌超凈臺上進行，且所用材料均采用紫外線滅菌處理。

1.4 糞便樣本檢測與數(shù)據(jù)分析 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB 法）提取糞便標本基因組DNA，應用16SV34 區(qū)域引物序列341F：CCTAYGGGRBGCASCAG、806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT 進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增；將PCR 產(chǎn)物進行磁珠純化，并根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳，然后采用膠回收試劑盒回收目的條帶以純化產(chǎn)物；最后使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample PreParation Kit 建庫試劑盒進行文庫構建，經(jīng)Qubit、Q-PCR 定量檢測構建文庫合格后使用NovaSeq6000 進行上機測序。

通過對測序序列（Reads）進行拼接、質(zhì)控和過濾，以97%的一致性將序列聚類成為基于序列間相似度的分類操作單元（operational taxonomic units，OTU），然后參照Silva138 數(shù)據(jù)庫對得到的OTU 序列進行物種注釋，并根據(jù)物種注釋情況進一步分析Alpha 多樣性、Beta 多樣性、物種豐度。

Alpha 多樣性分析包括：（1）稀釋曲線：是描述樣本多樣性的曲線，能夠直接反映樣本相關測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度。（2）Shannon 指數(shù)：為菌群物種Alpha 多樣性分析常用的指數(shù)，反映不同樣本間物種多樣性和均一性的差別，Shannon 指數(shù)越大說明菌群多樣性越高。

Beta 多樣性分析：是對兩組樣品間的菌群構成情況進行比較分析。主坐標分析（PCoA）是常用的Beta多樣性分析方法，其基于Unweighted Unifrac 距離來進行分析，樣本間距離越遠代表樣本間多樣性差異越大。

物種豐度分析采用T-test 檢驗和LEfSe 分析，其中LEfSe 分析是一種軟件分析，其能夠找到組間有統(tǒng)計學差異的生物標志物。

1.5 食管組織蘇木素-伊紅（HE）染色 完成糞便收集后處死兩組小鼠，剝?nèi)∑涫彻芙M織并采用4%多聚甲醛溶液固定，之后進行石蠟包埋、切片、HE 染色，觀察兩組小鼠食管組織病理改變。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，先進行方差齊性分析，之后進行T-test 檢驗。Anosim 相似性分析用于檢驗組間差異是否大于組內(nèi)，判斷實驗分組是否存在意義。基于兩兩樣本間的距離值排序獲得的秩（組間的為Between，組內(nèi)的為Within），這樣任一兩兩樣本的比較可以獲得3 個分類的數(shù)據(jù)，并進行箱線圖的展示（若兩個箱的凹槽互不重疊，則表明兩樣本的中位數(shù)有顯著差異）。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 食管組織病理改變 兩組小鼠在實驗過程中未出現(xiàn)死亡，MX 組小鼠均造模成功。DZ 組小鼠食管組織正常，MX 組小鼠食管組織可見鱗狀上皮增殖、癌巢形成且癌巢內(nèi)可見角化珠（圖1）。

圖1 兩組小鼠食管組織HE 染色結果（×200）Figure 1 HE staining results of esophagus tissues two groups of mice

2.2 腸道菌群測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估與OTU 分析 對兩組小鼠共20 例糞便標本進行16Sr DNA 基因測序，對檢測的原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)，平均每樣品測得86 110 條tags，經(jīng)過質(zhì)控平均得到83 261條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達54 489，質(zhì)控有效率達63.16%。然后基于有效數(shù)據(jù)進行分析共得到2 314 個OTU，再用OTU 序列進行物種注釋。結果共有862 個OTU 注釋到物種屬水平。

基于OTU 的Venn 圖中，2 種不同顏色的圓對應兩組小鼠糞便所含的菌群，重疊部分則為兩組共同含有的菌群，DZ 組較MX 組腸道菌群物種豐富程度明顯增加，兩組小鼠的腸道菌群結構存在差異，見圖2。同時選擇DZ 組與MX 組在門水平上豐度排名前10 的物種，繪制物種相對豐度柱狀圖（圖3），由圖可見，在門水平上兩組小鼠樣本部分物種豐度存在明顯差異，MX 組與DZ組相比，擬桿菌門（Bacteroidota）及厚壁菌門（Firmicutes）比例升高，而疣微菌門（Verrucomicrobiota）及變形菌門（Proteobacteria）比例降低。

圖2 兩組小鼠腸道菌群Venn 圖Figure 2 Venn diagram of intestinal flora between two groups of mice

圖3 兩組小鼠腸道菌群門水平物種相對豐度柱狀圖Figure 3 Relative abundance of species at phylum level intestinal flora of mice between two groups

2.3 兩組小鼠腸道菌群Alpha 多樣性分析

2.3.1 兩組小鼠腸道菌群物種多樣性曲線 兩組小鼠菌群稀釋曲線均趨于平坦，則說明目前樣本測序數(shù)據(jù)量漸進合理，即使增加數(shù)據(jù)量也只會產(chǎn)生少量新的物種，見圖4。

圖4 兩組小鼠菌群物種稀釋曲線Figure 4 Rarefaction curve of intestinal flora between two groups of mice

2.3.2 兩組小鼠腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)組間差異分析 MX 組腸道菌群Shannon 指數(shù)低于DZ 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 兩組小鼠腸道菌群Shannon 指數(shù)比較（±s）Table 1 Shannon Diversity Index analysis of intestinal flora between two groups of mice

表1 兩組小鼠腸道菌群Shannon 指數(shù)比較（±s）Table 1 Shannon Diversity Index analysis of intestinal flora between two groups of mice

注：DZ 組=對照組，MX 組=模型組

組別 只數(shù) Shannon 指數(shù)DZ 組 10 5.807±0.461 MX 組 10 4.549±1.450 t 值 2.614 P 值 0.024

2.4 兩組小鼠腸道菌群Beta 多樣性指數(shù)組間差異分析 PCoA 圖顯示，MX 組與DZ 組樣本基本上分別聚集在不同的象限，相距較遠，樣本間多樣性差異較大（t=22.444，P=0.004），見圖5。

圖5 兩組小鼠腸道菌群Beta 多樣性PCoA 圖Figure 5 PCoA diagram of Beta diversity in intestinal flora between two groups of mice

2.5 兩組小鼠腸道菌群組間差異物種分析

2.5.1 兩組小鼠腸道菌群組間與組內(nèi)差異性分析Anosim 相似性分析結果顯示，兩組小鼠腸道菌群差異組間大于組內(nèi)，差異有統(tǒng)計學意義（R=0.476，P=0.001），見圖6。

圖6 兩組小鼠腸道菌群Anosim 組間差異分析Figure 6 Analysis of similarities （ANOSIM） of intestinal flora between two groups of mice

2.5.2 腸道菌群差異物種分析 在門水平，MX 組未明確細菌（Unidentified_ Bacteria）、藍細菌（Cyanobacteria）、易感微生物（Elusimicrobia）、彎曲桿菌（Campilobacterota）豐度高于DZ 組，差異有統(tǒng)計學意義（P 均<0.05），見圖7。

圖7 兩組小鼠腸道菌群門水平差異分析Figure 7 Differential species analysis of intestinal flora at the phylum level between two groups of mice

在屬水平，共有27 類菌的豐度在兩組小鼠腸道菌群內(nèi)有差異（P 均<0.05）。豐度較高的前10 位腸道菌群：MX 組普雷沃菌科_UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）、擬桿菌屬（Bacteroides）、毛螺菌科NK4A136組（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、 瘤 胃 球 菌 屬（Ruminococcus）、普雷沃菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、普雷沃菌屬（Prevotella）、大腸埃希菌（Colidextribacter）、毛螺菌科_UCG-006（Lachnospiraceae_UCG-006）豐度高于DZ 組，羅姆布茨菌（Romboutsia）、土桿菌屬（Turicibacter）豐度低于DZ 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖8。

圖8 兩組小鼠腸道菌群屬水平差異分析Figure 8 Differential species analysis of intestinal flora at the genus level between two groups of mice

2.5.3 兩組小鼠腸道菌群LEfSe 分析 LEfSe 分析結果顯示，兩組共有21 種腸道菌群豐度有差異，其中梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、毛螺菌目（Lachnospirales）、Prevotellaceae_UCG-003、腸桿菌目（Enterobacterales）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、大腸埃希菌種（Escherichia_coli）、 顫 螺 旋 菌 目（Oscillospirales）、 擬 桿 菌 科（Bacteroidaceae）、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group、顫螺旋菌科（Oscillospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）豐度在MX 組升高，另外Peptostreptococcales_Tissierellales、Romboutsia_ilealis、Romboutsia、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、丹 毒 絲 菌 科（Erysipelotrichaceae）、 丹 毒 絲 菌 目（Erysipelotrichales） 豐 度 在DZ 組 升 高（P<0.05）。在 屬 水 平 上，Prevotellaceae_UCG-003、Escherichia-Shigella、Bacteroides、Lachnospiraceae_ NK4A136_group在MX 組 豐 度 增 高；Romboutsia 豐 度 在DZ 組 增 高（P<0.05），見圖9。

圖9 兩組小鼠腸道菌群LEfSe 分析柱狀圖Figure 9 Histogram of LEfSe analysis of intestinal flora between two groups of mice

3 討論

腸道是一個復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其擁有一個密集而多樣的微生物群落，稱之為腸道菌群，該菌群與宿主共同進化以建立相互關系［5］。腸道菌群對宿主健康的主要作用表現(xiàn)在分解不可消化的碳水化合物［6］、合成維生素［7］、調(diào)節(jié)宿主防御［8］及調(diào)控腫瘤［9］，尤其在腫瘤生長過程中發(fā)揮了重要作用。已有研究表明腸道菌群與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療效果密切相關，如結直腸癌［10-11］、肺癌［12］、胃癌［13］、肝癌［14］、黑色素瘤［15-16］等。目前有關腸道菌群在結直腸癌方面的研究較多，已發(fā)現(xiàn)部分特異性差異菌群，并進行了深入的機制研究，如研究發(fā)現(xiàn)Colidextribacter 通過增加癌基因bcl-2 和bcl-xl 的表達，抑制結腸細胞凋亡，從而促進腫瘤的形成［17］。產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌可產(chǎn)生脆弱擬桿菌毒素，與結腸上皮細胞相互作用，激活調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞并降低白介素（IL）-2 水平，隨著IL-2 水平的下降，輔助性T 淋巴細胞（Th17）的產(chǎn)生導致IL-17 水平升高，促進癌細胞存活和增殖［18］。雙歧桿菌能增強樹突狀細胞功能，導致腫瘤微環(huán)境中CD8+T 細胞的啟動和聚集介導效應，從而增加程序性死亡受體-配體1（PD-L1）特異性抗體治療效果，抑制結腸癌的發(fā)展［19］。

關于腸道菌群和食管鱗癌相關性的研究較少，目前文獻已報道的差異菌群多為從口腔取材，腸道菌群報道較少。位俊敏等［20］研究發(fā)現(xiàn)食管癌患者口腔中卟啉菌屬表達升高。ZHAO 等［4］報道食管癌患者唾液菌群中顯著增加的菌群為Firmicutes、革蘭陰性菌門（Negativicutes）、硒單胞菌門（Selenomonadales）、Prevotellaceae、Prevotella 和韋榮菌科（Veillonellaceae），而Proteobacteria、β-變形桿菌門（Betaproteobacteria）、奈瑟菌目（Neisseriales）、奈瑟菌科（Neisseriaceae）和奈瑟菌屬（Neisseria）則顯著減少。而DENG 等［21］研究發(fā)現(xiàn)在屬水平上，食管鱗癌患者糞便中鏈球菌（Streptococcus）、 雙 歧 桿 菌（Bifidobacterium）、Subdoligranulum、布勞特菌屬（Blautia）、Romboutsia、柯林斯菌屬（Collinsella）、Paeniclostridium、多爾菌屬（Dorea）和阿托波菌屬（Atopobium）豐度顯著增加，而毛螺菌屬（Lachnospira）、Bacteroides、Agathobacter、Lachnoclostridium、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、帕拉普菌屬（Paraprevotella）等菌屬豐度降低。可見上述研究報道的菌群存在很大差別，縱觀之前文獻報道的雖為同一類型腫瘤患者，但腸道菌群中檢測出的具有統(tǒng)計學意義的菌群差別也較大，考慮腸道菌群是一個復雜的微環(huán)境，容易受到患者飲食、情志、基礎疾病及藥物等的影響，故本研究選取4NQO 原位誘導食管癌模型小鼠糞便為檢測標本，最大限度使飲食、環(huán)境等外界因素達到統(tǒng)一性，盡量避免誤差。

本研究結果顯示，MX 組與DZ 組相比腸道菌群的物種豐富度和多樣性明顯降低。兩組腸道菌群差異物種分析顯示，MX 組小鼠糞便中Prevotellaceae_UCG-003、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcus、Prevotellaceae_UCG-001、Prevotella、Colidextribacter、Lachnospiraceae_UCG-006 豐度高于DZ組，Romboutsia、Turicibacter 豐度低于DZ 組。LEfSe 分析結果顯示，在屬水平上，Prevotellaceae_UCG-003、埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、Bacteroides、Lachnospiraceae_ NK4A136_group 在MX 組 豐 度 明 顯增高，Romboutsia 豐度在DZ 組明顯降低。兩種檢驗分析中均有統(tǒng)計學差異的菌屬為Prevotellaceae_UCG-003、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group 和Romboutsia，這4 種菌屬可能更具有生物標志物意義。Bacteroidota 是腸道菌群的主要成分，其與Firmicutes約占腸道菌群的90% 以上，研究證實擬桿菌屬（Bacteroidetes）在結直腸癌患者糞便菌群中豐度明顯增高［22-23］，并有研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬在食管鱗癌診斷中準確率較高［21］；Prevotellaceae 在食管癌患者口腔菌群中及結直腸癌患者糞便菌群中豐度雖有明顯增高［4，24］，但本研究結果與其一致。但Lachnospiraceae_NK4A136_group 及Romboutsia 在結直腸癌及胃癌等腫瘤患者中豐度雖有明顯變化［21，25-26］，但本研究結果與之不同，因此還需進一步研究檢測確定。

綜上所述，食管鱗癌原位模型小鼠腸道菌群物種多樣性降低，存在特異性差異菌屬，可為食管癌的診斷提供參考。雖然本研究發(fā)現(xiàn)了MX 組較DZ 組小鼠腸道菌群顯著改變，但16SrDNA 為半定量檢測，故仍需宏基因組學或靶向微生物學的研究進一步明確差異菌群，并進行更加深入的機制研究來進行驗證，尋找食管鱗癌特異性的靶菌群。

作者貢獻：張玉雙、李晶進行文章的構思與設計，負責文章的質(zhì)量控制及審校；張玉雙、于富洋、吳忠冰、王一然進行數(shù)據(jù)收集；張玉雙、于富洋、吳忠冰整理數(shù)據(jù)；于富洋、吳忠冰進行統(tǒng)計學處理；張玉雙負責結果的分析與解釋、撰寫與修訂論文；李晶對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。