基于網絡藥理學和分子對接技術探討瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的作用機制

王兆博，俞儀萱，王俊志

冠心病是世界范圍內的難治愈性疾病。世界衛生組織統計顯示，全球心血管疾病患病率呈持續升高趨勢，2020年全球范圍內因缺血性心臟病死亡的病人已超過1 000萬例[1]。我國2016年心血管病死亡率居首位，遠高于腫瘤等其他疾病[2]。目前藥物治療冠心病局限于改善癥狀及通過降脂穩斑，抗血小板，以減少不良事件發生，無藥物可徹底治愈冠心病[3]，介入治療可大幅改善病人生活質量。瓜蔞薤白半夏湯是醫圣張仲景的經典名方，由瓜蔞、薤白、半夏、白酒組成，具有通陽散結、祛痰寬胸的功效，是臨床治療冠心病的常用方劑。實驗研究表明，瓜蔞薤白半夏湯能改善心肌供血，保護缺血心肌，降低再灌注損傷[4-5]，但作用機制尚未明確。本研究采用網絡藥理學與分子對接技術探討瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病(胸痹)的作用機制，以期為實驗研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 方藥成分化合物與網絡構建 運用中藥系統藥理學技術平臺(TCMSP)數據庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索各中藥的化學成分和靶蛋白信息，將口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18作為篩選標準。若TCMSP數據庫中未檢索到有關化合物，再查詢中國科學院上海有機化學研究所化學專業數據平臺(http://www.organchem.csdb.cn)進行補充。將靶蛋白信息錄入UniProt網站(http://www.uniprot.org/)，選擇物種為智人(Homo Sapiens)，檢索藥物靶點蛋白對應的基因名。將數據資料導入Cytoscape 3.5.1軟件，構建“中藥-化合物-靶基因”可視化網絡圖。

1.2 冠狀動脈粥樣硬化疾病靶基因篩選 登錄基因數據庫對冠心病靶點基因進行查詢，關鍵檢索詞為：“coronary vasospasm”“coronary stenosis”“coronary artery disease”“coronary disease”“coronary atherosclerosis”“coronary thrombosis”。基因數據庫名稱及網址詳見表1。

表1 基因數據庫列表

1.3 韋恩圖與蛋白-蛋白互作(PPI)網絡圖構建 將藥物、疾病靶點信息錄入微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)制作韋恩圖，并取疾病與藥物靶點交集，導入STRING網站及Cytoscape 3.5.1構建PPI網絡，對交集靶點網絡的節點進行分析與計算。運用兩種方法對關鍵靶點進行篩選與分析：篩選度值(Degree)居前10位的靶點；篩選大于Degree及介度中心性(BC)、接近中心性(CC)、網絡中心性(NC)、局部性連接(LAC)中位數的靶點，將兩種方法篩選出的核心靶點進行整合分析。

1.4 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將藥物與疾病交集基因錄入Metascape網站(http://metascape.org/)進行GO分子功能(GO-MF)、GO細胞成分(GO-CC)、GO生物過程(GO-BP)及KEGG分析，導出主要通路的KEGG通路圖并將數據導入OmicShare(https://www.omicshare.com)網站繪制柱狀及氣泡圖。篩選出與冠心病相關的通路，結合關聯的藥物成分、核心靶點，篩選出核心通路。

1.5 分子對接及圖形可視化 運用分子對接技術對關鍵藥物化合物-靶點關系進行驗證。檢索PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)及ZINC數據庫(http://zinc.docking.org/)下載核心靶點蛋白PDB文件及與其對接的化合物分子MOL文件，導入AutoDock 4.2軟件進行分子對接，將對接數據導入PyMOL 2.3.2軟件進行可視化分析。

2 結 果

2.1 方劑有效成分篩選 共篩選出32種藥物化合物，其中瓜蔞10種，薤白11種，半夏12種，薤白、半夏同時含有的化合物1種，為β-谷甾醇(beta-sitosterol)。詳見表2。

表2 方劑有效成分

(續表)

2.2 藥物化合物-靶點網絡構建 整合檢索基因數據并篩選后得到155個藥物基因靶點，并將數據導入Cytoscape 3.5.1軟件進行可視網絡構建，網絡共包含190個節點、372條邊，詳見圖1。Degree值居前5位的化合物分別是柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇 (beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、松柏苷(coniferin)、槲皮素(quercetin)。詳見表3。

圖1 藥物靶點網絡圖

表3 核心化合物信息表

2.3 藥物與疾病的靶點韋恩圖 檢索各基因靶點數據庫后篩選出疾病基因靶點3 127個，中藥靶點155個(其中半夏65個，瓜蔞15個，薤白133個)，藥物與疾病重疊靶點116個。詳見圖2。

圖2 藥物與疾病靶點韋恩圖

2.4 藥物與疾病PPI網絡構建 錄入疾病及藥物重合靶點，通過STRING網站及Cytoscape 3.5.1軟件對PPI網絡進行構建，網絡共包含98個節點、1 318條邊。根據Degree值分析法及關聯系數分析法篩選出核心靶點，詳見圖3、圖4及表3、表4。各系數的中位數分別是Degree值12.5、BC 0.014、CC 0.503、NC 19.556、LAC 16.333，兩種方法所篩選出的重合靶點為磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基(PIK3CA)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、雌激素受體1(ESR1)、雄激素受體(AR)。

圖3 度值法疾病-藥物靶點PPI網絡圖

圖4 關聯系數法疾病-藥物靶點PPI網絡

表3 核心靶點篩選表

表4 核心靶點-中藥化合物對應關系

2.5 GO及KEGG富集分析 通過富集分析共得到131條通路，篩選出與冠心病相關的核心通路11條。詳見圖5～圖8及表4。

圖5 GO富集分析氣泡圖(A為BP；B為CC；C為MF)

圖6 KEGG富集分析氣泡圖(CAD為冠心病)

圖7 磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路圖

表4 冠心病的相關核心通路

(續表)

2.6 分子對接及可視化驗證 對血管內皮生長因子受體(KDR)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、一氧化氮合酶3(NOS3)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)進行分子對接驗證，所有對接關系的結合能<0，說明分子間具有結合趨勢，其中PTGS2與豆甾醇對接能力最強，證實了化合物可作用于對應的靶點。詳見表5、圖8。

表5 分子對接信息 單位：kJ/mol

圖8 分子對接圖(A為KDR與柚皮素；B為VEGFA與柚皮素；C為NOS3與槲皮素；D為PTGS2與豆甾醇)

3 討 論

中藥方劑成分復雜，具有不同的藥代動力學特征和復雜的藥理學作用。目前中藥潛在的作用機制尚未明確，仍需深入分析。網絡藥理學是將藥物-疾病-靶點通過復雜網絡進行關系拓撲，深入挖掘化合物與靶點之間的互作關系，為中藥方劑的復雜作用機制提供了有效的研究方法。

冠心病屬中醫學“胸痹”“真心痛”“厥心痛”范疇，醫圣張仲景《金匱要略》提出“陽微陰弦”是“胸痹心痛”的主要病機，并于《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治第九》立方瓜蔞薤白半夏湯，記載“胸痹不得臥，心痛徹背者，栝樓薤白半夏湯主之”，方劑由栝樓實(一枚，搗)、薤白(三兩)、半夏(半升)、白酒(一斗)組成。

本研究檢索TCMSP數據庫，篩選出瓜蔞、薤白、半夏對應化合物32種，Degree值居前5位的分別為柚皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、松柏苷、槲皮素。檢索各基因數據庫獲得藥物與疾病重疊靶點100個；篩選出PIK3CA、MMP2等13個核心靶點；分子對接結果顯示KDR、VEGFA、NOS3、PTGS2與對應化合物之間的結合能均<0，說明存在結合趨勢；通過富集分析共得到PI3K-Akt、RAS、Rap1、VEGF等10條與冠心病相關的核心通路。篩選核心靶點的過程中采用關聯系數法及度值法進行分析，兩種篩選方法重疊的核心靶點共4個(PIK3CA、MMP2、ESR1、AR)。分析結果差異的部分原因，可能是兩種方法對靶點不同性質評價存在差異性所致，DC、CC、NC、LAC等系數側重于評價節點之間的關聯聚類性，Degree反映靶點間作用關系數量的多少。

將核心靶點與冠心病相關通路、關鍵化合物整合后發現，核心靶點密集性分布在PI3K-Akt、RAS、Rap1等10條通路上，其中PI3K-Akt富集的核心靶點最多；薤白含有的柚皮素藥效分布廣泛，作用于VEGFA、SRC、KDR等9個核心靶點；瓜蔞、薤白、半夏中的13種化合物(β-谷甾醇、豆甾醇等)同時作用于PI3K-Akt通路中的PTGS2，為關聯化合物最多的靶點。本研究具有關鍵化合物作用于核心靶點并集中富集于PI3K-Akt、VEGF等冠心病相關通路的特點，且出現了柚皮素等關鍵化合物同時作用于大量核心靶點的情況，一定程度說明本研究方法具有可行性。

柚皮素屬于黃酮類化合物，是薤白的主要藥物成分之一，是天然的超氧化物、過氧自由基清除劑，具有明顯的抗氧化和抗炎作用[6]。柚皮苷通過調控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，下調一氧化氮的生物利用度和氧化應激反應，減少血管平滑肌細胞的遷移及脂質條紋的增殖[7-8]。柚皮素能改善線粒體功能，保護梗死和缺血損傷的心肌。豆甾醇、β-谷甾醇存在于薤白、半夏中，可競爭性抑制總膽固醇吸收，誘導膽固醇轉運體——ABCA/ABCG系列蛋白的表達，抑制炎癥過程中巨噬細胞對修飾脂蛋白的攝取[9]，從而抑制斑塊內炎癥與脂質沉積的過程[10-11]。調節多通路發揮對缺血再灌注損傷心肌的保護作用，減少缺血/再灌注損傷及心肌梗死后凋亡面積[12]。多項研究證實，豆甾醇、β-谷甾醇具有延緩動脈硬化，逆轉動脈斑塊的作用[13-14]。槲皮素是人參、薤白、甘草等中藥的主要成分之一，結構中存在活性羥基，通過抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和黃嘌呤氧化酶，減少活性氧(ROS)形成，降低環氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)活性，調節炎癥反應細胞內的信號活性，具有抗氧化、內皮保護、血管擴張等功能[15]。有研究顯示，經槲皮素治療2個月后，冠心病病人白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α及IL-10水平均有不同程度降低[16]，通過靜脈注射槲皮素能減少急性心肌梗死壞死面積[17-18]。

PI3K-Akt通路廣泛調控細胞增殖、分化、凋亡等多個生物學過程[19]，VEGF是血管內皮組織增殖過程中重要的調節蛋白[20]，VEGF家族內多種生長因子均引起PI3K磷酸化成為肌醇磷脂產物并激活下游Akt，PI3K-Akt通路被激活后可抑制血管平滑肌細胞遷移，減少血小板黏附，下調血管內皮細胞中組織因子表達，減輕血管內皮細胞凋亡，從而發揮保護內皮的作用[21]；另一方面，巨噬細胞中的PI3K被氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、血管緊張素Ⅱ激活，可加強巨噬細胞自噬，增強免疫炎癥反應[22]。NOS3編碼的蛋白是磷酸化Akt下游重要的底物，也是內源性NO分泌的重要來源[23]。缺氧狀態下，NOS3通過活化的PI3K-MAPK信號誘導HIF-1促進心血管再生，調節代謝性應激反應，從而適應缺血環境[23-24]。eNOS是NOS3基因表達的重要蛋白，也是PI3K-Akt重要的下游信號之一，Tsang等[25]對大鼠離體心臟構建缺血/再灌注損傷模型，發現缺血處理可使磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化eNOS(p-eNOS)表達增加。PI3K抑制劑可抑制Akt磷酸化，其心臟保護作用同時消失，提示缺血預處理可經PI3K-Akt-eNOS信號通路發揮保護缺血心肌的作用。eNOS可抑制血小板的聚集及組織因子的表達[26]，阻斷誘導損傷的冠狀動脈形成血栓[27]。

本研究局限性：不同數據庫內錄入的疾病基因差異較大，缺乏統一的靶點篩選標準，采用的方法仍需更多論證；未能獲得原方中“酒”統一的化學成分；復雜網絡模型是根據既往實驗得到的基因數據所構建的，結果仍需實驗驗證。

綜上所述，柚皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、松柏苷、槲皮素可能是瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病起關鍵作用的化合物，可能通過作用于PTGS2、PIK3CA、MMP2、VEGFA等靶點對RAS、Rap1、VEGF等通路進行調控，而PI3K-Akt可能是瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的核心通路。