木犀草素對心力衰竭大鼠心肌炎癥反應和TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響

史朋曉，宋媛媛，閆洪娟

心力衰竭發病機制復雜，免疫炎癥反應在其中發揮著重要作用，免疫炎癥反應異常激活促進心力衰竭進展，抗炎可能是治療心力衰竭的新方法[1]。木犀草素是從多種瓜果蔬菜和天然藥材中分離出的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種活性[2]。劉昕等[3]研究顯示，木犀草素通過減輕心肌細胞線粒體損傷，抑制外周血淋巴細胞DNA損傷發揮對心力衰竭的保護作用[4]。炎癥反應在心力衰竭發病中發揮著重要作用，Toll樣受體4/髓樣分化因子88/核轉錄因子-κB(TLR4/MyD88/NF-κB)信號通路為介導炎癥反應的主要通路[5]。本研究觀察木犀草素對心力衰竭大鼠心肌炎癥反應和TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響，從炎癥反應方面進一步探討木犀草素對心力衰竭保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器 實驗動物：清潔級雄性SD大鼠[河北省實驗動物中心，許可證號：SCVK(冀)2014-0015]，體質量210～230 g。實驗試劑和儀器：木犀草素(美國Sigma公司)，蘇木精、伊紅(上海朗瑞)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(加拿大HCB公司)，放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，兔抗鼠白細胞介素1β(IL-1β)多克隆抗體、兔抗鼠白細胞介素6(IL-6)多克隆抗體、兔抗鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)多克隆抗體、兔抗鼠TLR4多克隆抗體、兔抗鼠MyD88多克隆抗體、兔抗鼠NF-κB p65多克隆抗體(英國Abcam公司)；超聲儀(HP SONOS 5500，美國惠普公司)。

1.2 實驗動物分組 采用隨機數字表法將51只大鼠分為假手術組(S組)、心力衰竭組(H組)和木犀草素治療組(L組)，每組17只大鼠。

1.3 心力衰竭模型建立 采用開胸手術建立心力衰竭動物模型。H組和L組大鼠建立模型：將大鼠稱重，麻醉成功后，固定于手術板上，刮凈胸骨左側心前區毛發，頸部墊高，氣管插管，連接呼吸機，常規消毒、鋪巾，于大鼠心尖搏動最強處沿肋骨切開皮膚，分離筋膜、肌肉、胸膜，打開腹腔，暴露心臟，小鑷子撕破心包，擠壓右側胸廓，暴露心臟左心室，辨別肺動脈圓錐和左心耳，在兩者交界下方2 mm處使用縫合針結扎心臟前降支，觀察心臟由紅潤變蒼白時，迅速將心臟歸位。S組大鼠結扎時打松結，其他步驟同建模組。術后3周，采用心臟超聲判斷心力衰竭情況，以左室射血分數(LVEF)<50%為心力衰竭模型建立成功。建模失敗的大鼠重新取大鼠按照上述步驟建立模型作為補充。

1.4 給藥 建模成功后，L組大鼠給予50 mg/(kg·d)木犀草素(體積3 mL)灌胃，S組和H組大鼠給予50 g/L羧甲基纖維素鈉3 mL灌胃，共10 d[3-4]。

1.5 心臟超聲測定心臟收縮功能 給藥10 d后，于第11天進行心臟超聲檢查，指標包括LVEF、短軸縮短率(FS)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)。

1.6 實驗取材 超聲檢查結束后，使用內眥取血法采集血液3 mL，以3 000 r/min離心10 min，分離血清備用。取血后稱重大鼠，麻醉處死大鼠，開胸，取出心臟，將心臟橫切為兩塊，一部分組織置于甲醛溶液固定，另一部分組織置于液氮中凍存。

1.7 蘇木精-伊紅(HE)染色 將甲醛溶液中的心臟組織取出，梯度乙醇脫水、二甲苯脫乙醇，石蠟包埋，切成5 μm切片，進行常規HE染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水，蘇木精染色5～10 min，伊紅染色1 min，乙醇脫水，二甲苯透明，封片后，鏡下觀察心肌組織形態學變化。

1.8 Masson染色 取心肌組織石蠟切片，脫蠟至水，Masson染色液染色5 min，磷鉬酸染色5 min，亮綠染色2 min，分化液分化1 min，乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察染色情況，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件計算膠原面積比，膠原面積比=膠原纖維面積/心肌面積×100%。

1.9 血清腦鈉肽(BNP)、IL-1β、IL-6、TNF-α水平測定 采用雙抗夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.10 心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平測定 采用蛋白免疫印跡法測定心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平，取出液氮中心肌組織，剪取100 mg置于EP管中，剪碎，加入RIPA裂解液，使用研磨器充分研磨制作勻漿，提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉液中封閉2 h，加入一抗(1∶300)以β-actin為內參，過夜孵育，加入二抗孵育1 h，經洗滌、顯影、灰度掃描，采用Image J軟件測定條帶灰度值。蛋白水平=目標蛋白灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結 果

2.1 各組心臟超聲指標比較 與S組比較，H組LVEF、FS降低(P<0.05)，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV增加(P<0.05)；與H組比較，L組LVEF、FS升高(P<0.05)，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組心臟超聲指標比較(±s)

2.2 木犀草素對心臟HE染色的影響 HE染色結果顯示：S組大鼠心肌排列整齊，結構清晰，無壞死心肌和炎癥浸潤；H組大鼠心肌排列紊亂，可見大片心肌壞死和炎癥浸潤；L組大鼠心肌排列較整齊，心肌壞死和炎癥浸潤較輕。詳見圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色圖(×200)

2.3 木犀草素對心臟Masson染色的影響 Masson染色結果顯示：心肌細胞染色呈紅色，膠原纖維染色呈藍色。S組心肌膠原纖維含量少，H組心肌膠原纖維明顯增多，L組心肌膠原纖維較H組明顯減少。詳見圖2。與S組比較，H組膠原面積比增加(P<0.05)；與H組比較，L組膠原面積比降低(P<0.05)。詳見表2。

圖2 各組心肌組織Masson染色圖(×200)

表2 各組心肌組織膠原面積比比較(±s)

2.4 各組血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 與S組比較，H組血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與H組比較，L組血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.5 各組心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達比較 與S組比較，H組心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達升高(P<0.05)；與H組比較，L組心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達降低(P<0.05)。詳見表4、圖3。

表4 各組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白比較(±s)

圖3 各組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白條帶圖

2.6 各組心肌組織TLR4/MyD88/NF-κB通路相關蛋白表達水平比較 與S組比較，H組心肌組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平升高(P<0.05)；與H組比較，L組心肌組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平降低(P<0.05)。詳見表5、圖4。

表5 各組心肌組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平比較(±s)

圖4 各組心肌組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白條帶圖

3 討 論

心力衰竭不僅嚴重影響病人生活質量，也是嚴峻的公共衛生問題，故探討心力衰竭的機制具有重要的意義。建立良好的動物模型對研究心力衰竭具有重要的臨床價值。良好的動物模型可復制心力衰竭發病的整個過程，通過結扎冠狀動脈導致心肌缺血壞死，最終引起心力衰竭發生，接近臨床心力衰竭。本研究采用結扎心臟冠狀動脈前降支建立心力衰竭大鼠模型，結果顯示：心力衰竭模型組大鼠LVEF、FS降低，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV及血清BNP水平升高；心肌壞死和炎癥浸潤嚴重，膠原面積明顯增加。提示心力衰竭模型建立成功。

隨著心室重構學說和神經激素學說的提出，心力衰竭細胞因子學說逐漸被提出。細胞因子學說認為心力衰竭進展部分原因是心臟本身和外周循環炎性因子發生級聯反應導致的毒性作用造成的。有研究顯示，炎性因子水平升高導致的炎癥反應在心力衰竭進展中發揮著重要作用，是引起心室重構和心力衰竭惡化的重要原因[6]。心力衰竭時，IL-1β、IL-6、TNF-α等多種炎性因子水平明顯升高；這些炎性因子過度表達引起心排血量和心肌收縮力降低，誘導心肌細胞壞死和凋亡，造成心肌重塑惡性循環，進一步促進疾病發展[7]。本研究結果顯示：心力衰竭模型大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達水平升高。表明心力衰竭模型大鼠心肌組織和全身均存在炎癥反應。

木犀草素最初是從木犀草枝、莖、葉中分離得到的，是黃酮類植物中的一種化合物，通常以糖基化或糖苷形式在菊科、豆科等多種植物中存在，是山楂、野菊花、金銀花的主要活性成分之一[8-9]。木犀草素除具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化應激等作用外，對心血管也有保護作用[10]。木犀草素可保護缺氧-復氧損傷的心肌細胞[11]，通過抑制心肌細胞中缺氧依賴性L型鈣通道改善心臟損傷[12]，激活過氧化物酶Ⅱ減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[13]，抗氧化保護心肌缺血/再灌注損傷[14]。抗炎是木犀草素的主要作用之一，本研究從炎癥反應角度探討木犀草素對心力衰竭大鼠的作用，結果顯示：心力衰竭大鼠經木犀草素治療后LVEF、FS升高，LVESD、LVESD、LVEDV、LVESV降低，血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平降低。HE染色顯示心肌壞死和炎癥浸潤明顯減輕，Masson染色顯示心肌組織膠原面積比降低。表明木犀草素可能通過抑制心肌組織及全身炎癥反應，保護心肌細胞，減輕心肌壞死和炎癥反應，減小心肌膠原面積，發揮對心力衰竭的保護作用。

心臟炎癥反應包括自然免疫反應和獲得性免疫反應，自然免疫反應的主要特征為誘導產生炎性因子。本研究中，心力衰竭模型大鼠心肌組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平升高。心肌缺血并導致心力衰竭時發生自然免疫反應和炎癥反應。TLRs為一種重要的模式識別受體家族，可誘發自然免疫反應；TLR4為TLRs的一種類型，在心肌細胞中表達；TLR4可激活MyD88通路，最終激活NF-κB，NF-κB是激活炎癥反應的關鍵轉錄因子[15-16]。心肌梗死等心臟疾病發病過程中，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活，TLR4、MyD88、NF-κB p65水平升高[17]。本研究結果顯示，心力衰竭模型大鼠心肌組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活；心力衰竭模型大鼠經木犀草素治療后心肌組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平降低。木犀草素通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制炎癥反應發生[18]；通過TLR/MyD88/NF-κB信號通路，進而抑制急性痛風性關節炎大鼠炎癥反應[19]；通過抑制NF-κB活化抑制金黃色葡萄球菌誘發的乳腺炎炎癥反應[20]；通過TLR4/NF-κB干預腦梗死大鼠腦皮質炎癥反應[21]。結合本研究結果和既往研究結果可見：木犀草素可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活，降低心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子水平，抑制心肌組織炎癥反應，從而發揮對心力衰竭的保護作用。

綜上所述，木犀草素對心力衰竭大鼠心肌組織的保護作用可能與抑制心肌組織炎癥反應有關，其機制可能為木犀草素通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，進而抑制心肌組織炎癥反應，發揮對心肌組織的保護作用。