丁苯酞注射液預(yù)處理對腦缺血大鼠出血轉(zhuǎn)化及ERK5通路的影響

邵 婧，汪玉寶，張 淳，劉玉梅，趙 夢

缺血性腦卒中是由于腦供血?jiǎng)用}閉塞、狹窄或血栓等引起腦部供血不足，導(dǎo)致腦組織壞死的一類疾病，常引起神經(jīng)功能障礙、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病，且病情發(fā)展不可逆，對缺血性腦卒中病人身體健康帶來嚴(yán)重影響[1-2]。治療腦缺血的方法包括溶栓、手術(shù)、抗凝藥物等，溶栓治療具有較好的療效，但溶栓后易發(fā)生出血性轉(zhuǎn)化等并發(fā)癥，是病人死亡的主要原因，腦梗死面積越大出血轉(zhuǎn)化發(fā)生率越高，而炎癥反應(yīng)在腦梗死中發(fā)揮作用的同時(shí)也對腦內(nèi)出血轉(zhuǎn)化有一定的影響[3-4]。因此，緩解腦缺血引起的出血轉(zhuǎn)化的新型藥物是研究的熱點(diǎn)。腦缺血疾病發(fā)展過程中，機(jī)體炎性因子增多，神經(jīng)細(xì)胞、腦膠質(zhì)細(xì)胞功能紊亂。有研究顯示，丁苯酞參與腦缺血再灌注病理過程，具有清除自由基，抑制細(xì)胞凋亡，抗局灶性炎癥等，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方面發(fā)揮著積極作用，同時(shí)可減輕神經(jīng)功能損傷，但具體作用機(jī)制尚不明確[5-6]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(extracellular signal-regulated protein kinase 5，ERK5)是體內(nèi)普遍存在的信號系統(tǒng)之一，被缺血、高氧等多種刺激因素激活，通過磷酸化ERK5(phosphorylation ERK5，pERK5)將核外信號傳輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，與腦缺血引起的炎癥反應(yīng)、腦梗死、血小板活化、大腦損傷及神經(jīng)元死亡關(guān)系密切[7]。本研究通過構(gòu)建腦缺血大鼠模型，觀察經(jīng)丁苯酞注射液(NBP)預(yù)處理過的大鼠腦梗死、出血轉(zhuǎn)化及ERK5通路的變化，探討丁苯酞注射液的藥理機(jī)制，為腦缺血的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，約2月齡，體質(zhì)量250～280 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2016-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：省科委2000A027。所有大鼠飼養(yǎng)于本院動(dòng)物房中，自然光照，溫度25 ℃，相對濕度55%，自由進(jìn)食、進(jìn)水，保持動(dòng)物房環(huán)境整潔，每周清潔1次鼠籠，每日更新食物及飲用水。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 丁苯酞注射液(批號：101035-200901；規(guī)格：每瓶200 mg)，尼莫地平(山東新華制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：D14202003034；規(guī)格：每片2 mg)，三苯基氯化四氮唑(TTC)(Amresco生物公司生產(chǎn)，批號298964)，MAP激酶激酶5(MAP kinase kinase 5，MEK5)、ERK5、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte enhancer-binding factor 2C，MEF2C)，兔抗鼠單抗(批號：100953-T10、BCP1772400290、H00004208-D01P)、羊抗鼠IgG二抗(批號：RJC1793)均購自上海容創(chuàng)生物科技有限公司；β-actin抗體(貨號：C1843)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(貨號：E021010)購自中國博奧森公司；蘇木精染液(批號：YYJK-923)、伊紅染液(批號：230251)購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)試劑盒(批號：JK-201)購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡(批號：325435)購自上海普赫生物科技有限公司；GIS-500凝膠成像儀(批號：1306412)購自Miulab公司；分光光度儀(型號：DR6000)購自HACH公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥及模型制備 將118只健康SD雄性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、單純腦缺血再灌注組(模型組)、尼莫地平組[8.0 mg/(kg·d)]、NBP低劑量組[20 mg/(kg·d)]、NBP中劑量組[40 mg/(kg·d)]、NBP高劑量組[80 mg/(kg·d)][8]；其中假手術(shù)組18只，其余組各20只。參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行腦缺血再灌注損傷大鼠模型制備，將大鼠麻醉后進(jìn)行頸部皮膚消毒，經(jīng)頸正中切口暴露總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，使用絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，由頸外動(dòng)脈殘端插入尼龍線栓阻斷大鼠腦中動(dòng)脈血流，尼龍線栓直徑0.38 mm，插入深度為(19±1)mm，術(shù)中監(jiān)測大鼠心率、動(dòng)脈壓等，保證各項(xiàng)生理指標(biāo)均正常，之后立即按照給藥劑量腹腔注射相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水，2 h后拔除線栓，恢復(fù)血流后進(jìn)行再灌注，假手術(shù)組總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈暴露后不進(jìn)行線栓插入等處理，立即縫合。

1.3.2 腦缺血再灌注損傷大鼠模型神經(jīng)功能缺損評分 再灌注24 h后參考Longa等[10]分級法評定大鼠神經(jīng)功能，神經(jīng)功能無缺損計(jì)0分，出現(xiàn)雙側(cè)前肢屈曲等癥狀計(jì)1分，出現(xiàn)行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)等癥狀計(jì)2分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒計(jì)3分，意識喪失或無法獨(dú)立行走計(jì)4分，重復(fù)評定3次，評分1～3分提示模型構(gòu)建成功。剔除死亡和評分不合格的大鼠，各組大鼠建模成功18～20只，共建模成功93只，模型構(gòu)建成功率為93%。

1.3.3 TTC法測定大鼠腦梗死面積 造模后24 h，每組各選取3只大鼠，將其麻醉后斷頭取腦，去除額極、枕極，沿冠狀面行切片處理，厚度約2 mm，將切片置于2%TTC磷酸緩沖鹽溶液中，染色并固定24 h，無梗死區(qū)呈紅色，梗死區(qū)呈白色，拍照觀察后使用Image-pro Plus 6.0計(jì)算腦梗死面積，腦梗死面積=全腦梗死面積/全腦面積×100%。

1.3.4 分光光度法測量梗死區(qū)腦組織血紅蛋白含量 參照文獻(xiàn)[11]測定大鼠腦中血紅蛋白含量評估出血轉(zhuǎn)化量，各組取6只大鼠全腦組織去除腦干和小腦，加入組織裂解液進(jìn)行勻漿處理，取2 mL腦組織勻漿離心后取上清液，540 nm處測得吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到血紅蛋白含量。取非實(shí)驗(yàn)正常大鼠，麻醉后取腦，取心臟血液(0 μL，2 μL，4 μL，8 μL，16 μL)與正常腦組織勻漿混勻后離心，取上清液測定吸光度，采用測得的吸光度值與相應(yīng)血紅蛋白光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察腦組織出血情況 選取3只大鼠腦組織行HE染色，將組織置于生理鹽水中漂洗干凈，采用4%多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)低濃度到高濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后使用切片機(jī)進(jìn)行切片，得到常規(guī)病理切片，之后進(jìn)行蘇木精染色，伊紅復(fù)染，脫水封片，具體操作按照說明書進(jìn)行。封片后于高倍鏡下觀察出血情況。

1.3.6 蛋白免疫印跡法檢測大鼠腦組織MEK5、p-MEK5、ERK5、p-ERK5、MEF2C、p-MEF2C蛋白表達(dá)量 取各組6只大鼠腦組織0.25 g，使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌后研磨，加入蛋白裂解液后置于冰上靜置30 min，離心并收集上清液，參照BCA試劑盒說明書測定其蛋白濃度，配制8%分離膠、5%濃縮膠，取50 μg蛋白上樣，電泳開始時(shí)設(shè)置電壓為80 V，進(jìn)入分離膠電泳時(shí)電壓升高至120 V，電泳結(jié)束后，將目的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，電壓為110 V，反應(yīng)時(shí)間1 h，轉(zhuǎn)膜完成后使用TBST溶液清洗，加入5%脫脂牛奶于室溫下封閉1 h，TBST洗滌后加入一抗(MEK5、p-MEK5、ERK5、p-ERK5、MEF2C、p-MEF2C、GAPDH抗體，稀釋倍數(shù)1 ∶1 000)，4 ℃過夜，經(jīng)TBST洗滌后加入羊抗鼠IgG二抗(稀釋倍數(shù)1∶5 000)，室溫下孵育2 h，TBST清洗后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，置于凝膠成像儀中觀察各組蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.05)；與模型組比較，NBP各劑量組和尼莫地平組大鼠神經(jīng)功能缺損評分呈下降趨勢(P<0.05)，且NBP預(yù)處理組呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；NBP高劑量組與尼莫地平組神經(jīng)功能缺損評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s) 單位：分

2.2 NBP預(yù)處理對大鼠腦梗死面積的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死面積增加(P<0.05)；與模型組比較，NBP各劑量組和尼莫地平組腦梗死面積減小(P<0.05)，且NBP預(yù)處理組呈一定劑量效應(yīng)關(guān)系；NBP高劑量組與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 大鼠腦組織TTC染色情況

表2 各組大鼠腦梗死面積比較(±s) 單位：%

2.3 NBP預(yù)處理對大鼠出血轉(zhuǎn)化的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血紅蛋白含量升高，出血點(diǎn)增多(P<0.05)；與模型組比較，NBP各劑量組和尼莫地平組大鼠血紅蛋白含量降低(P<0.05)，且NBP預(yù)處理組呈一定劑量效應(yīng)關(guān)系；NBP高劑量組與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 大鼠腦組織HE染色圖(×400)

表3 各組大鼠血紅蛋白含量比較(±s) 單位：μg/半球

2.4 各組大鼠MEK5、ERK5、MEF2C蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠p-ERK5/ERK5、p-MEK5/MEK5、p-MEF2C/MEF2C表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，NBP各劑量組和尼莫地平組大鼠p-ERK5/ERK5、p-MEK5/MEK5、p-MEF2C/MEF2C蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，且NBP預(yù)處理組呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；NBP高劑量組與尼莫地平組p-ERK5/ERK5、p-MEK5/MEK5、p-MEF2C/MEF2C比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 大鼠腦組織p-MEK5、MEK5、p-ERK5、ERK5、p-MEF2C、MEF2C蛋白表達(dá)電泳圖(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為NBP低劑量組；D為NBP中劑量組；E為NBP高劑量組；F為尼莫地平組)

表4 各組大鼠p-MEK5、MEK5、ERK5、p-ERK5、MEF2C、p-MEF2C蛋白表達(dá)比較(±s)

3 討 論

缺血性腦損傷機(jī)制復(fù)雜，機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、鈣離子超載、神經(jīng)元凋亡等均被認(rèn)為參與腦損傷過程，是高致殘率、高致死率、高復(fù)發(fā)率的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，大腦中動(dòng)脈栓塞、狹窄、閉塞，血栓形成，低血壓等因素均可導(dǎo)致該疾病發(fā)生，神經(jīng)功能缺損又加劇各種心腦血管并發(fā)癥發(fā)生，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量及心理健康，給病人家庭及社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[12-13]。目前，急性缺血性腦卒中以機(jī)械性取血栓和溶栓治療為主，從而形成再灌注，常導(dǎo)致腦梗死及出血轉(zhuǎn)化情況，對病人生命造成較大威脅，因此，構(gòu)建腦缺血大鼠對研究腦缺血疾病具有重要的臨床意義。構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型的方式有多種，其中，線栓法是公認(rèn)的較理想的模型構(gòu)建方法，在研究中應(yīng)用廣泛[14]。本研究采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積大于假手術(shù)組，表明腦缺血再灌注對大鼠神經(jīng)功能及腦組織造成較大的損傷，提示大鼠腦缺血再灌注損傷模型構(gòu)建成功。

有研究顯示，腦缺血易引發(fā)腦梗死等，腦梗死同時(shí)引發(fā)腦部炎癥反應(yīng)，加重顱內(nèi)出血等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致全身出血，對病人生命造成威脅[15]，因此，研究新型腦缺血治療藥物是近年來的研究熱點(diǎn)。丁苯酞是從芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素消旋體，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。多項(xiàng)研究顯示，丁苯酞對急性缺血性腦卒中病人的神經(jīng)功能損傷有改善作用，可能通過減少腦水腫、縮小腦梗死面積、改善血腦屏障通透性和腦能量代謝、抗炎及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過NBP預(yù)處理的大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積均低于模型組，且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，表明丁苯酞注射液具有保護(hù)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能及改善腦梗死的作用。

相關(guān)研究顯示，溶栓治療大面積腦梗死后易引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥反應(yīng)及腦組織出血，加重腦損傷，提高腦梗死病人死亡率，因此尋找緩解腦梗死后出血轉(zhuǎn)化的藥物為治療腦缺血提供了新方向[18-19]。ERK5是絲裂原活化蛋白激酶家族成員，易被多種炎性因子激活，在血小板活化中發(fā)揮調(diào)控作用，可能參與動(dòng)脈血栓形成。MEK5是ERK5獨(dú)特的特異性上游激酶，可特異性激活ERK5，活化的ERK5誘導(dǎo)p-ERK5表達(dá)升高，進(jìn)而發(fā)揮抗神經(jīng)元損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用，ERK5同時(shí)又激活MEF2C，使MEF2C去磷酸化具有轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)機(jī)體胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)作用。有研究顯示，激活的MEK5-ERK5-MEF2C信號通路對腦缺血引起的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用，可能緩解腦缺血引起的腦出血轉(zhuǎn)化情況[20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)NBP預(yù)處理的大鼠血紅蛋白含量及腦出血量降低，腦組織p-ERK5/ERK5、p-MEK5/MEK5、p-MEF2C/MEF2C水平升高，表明丁苯肽注射液能有效減輕腦缺血大鼠出血轉(zhuǎn)化情況，可能通過激活MEK5-ERK5-MEF2C通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，丁苯酞注射液對腦缺血大鼠具有一定的療效，可能通過激活MEK5-ERK5-MEF2C通路，緩解出血轉(zhuǎn)化，減少腦梗死面積等發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用，為臨床治療腦缺血提供新思路。本研究未通過抑制該通路進(jìn)行對照，存在一定的不足，仍需進(jìn)一步研究。