鹽酸氯丙嗪急性中毒致死小鼠血漿中差異代謝物的篩選

劉鑫鑫，白 銳，劉文喬，謝 冰，文 迪，馬春玲*

(1.河北醫科大學法醫學院2017級，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學法醫學院，河北省法醫學重點實驗室，河北省法醫分子鑒定協同創新中心，河北 石家莊 050017；3.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018)

鹽酸氯丙嗪，又名冬眠靈，為第一代典型抗精神病藥物[1]，屬于中樞多巴胺受體的拮抗劑[2]，具有抗精神病、降溫、鎮靜、鎮吐、催眠等多種藥理活性[3]，可廣泛抑制中樞系統[4]，小劑量用于精神性障礙疾病治療[5]，但大劑量可致嗜睡、視力模糊、意識障礙、呼吸抑制、直立性低血壓、持續性低血壓休克甚至心搏驟停[6-8]。用藥不規范或者服毒自殺等情況導致過量鹽酸氯丙嗪中毒時有發生[9]，但目前鹽酸氯丙嗪中毒的鑒定尚缺乏科學的判斷標準。非靶向代謝組學是一種研究生物樣品中所有內源性代謝物的方法[10],能最大程度反映生物體總的代謝物信息，對生物體內小分子代謝物進行定性、定量分析，發現潛在的生物標志物[11-14]。本研究采用非靶向代謝組學方法，通過多元統計分析方法篩選出鹽酸氯丙嗪中毒小鼠血漿內差異代謝物，進而為鹽酸氯丙嗪中毒致死案件的鑒定提供方法及法醫學理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 選取SPF級 ICR小鼠24只，鼠齡7～8周，雌雄各半，體重(38±5)g，由遼寧沈陽長生公司提供，動物許可證號：SCXK(遼)2015-0001，動物飼料、水、光照、環境濕度、環境溫度均有嚴格要求。

1.1.2儀器與材料 UltiMateTM3000高效液相色譜儀串聯Q ExactiveTMFocus質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Acquity HSS T3 色譜柱(2.1 mm×100 mm 1.8 μm；美國 Waters 公司)，高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)，旋渦振蕩器(美國CORNING公司)，KQ-500DE型數控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)，Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)，鹽酸氯丙嗪(大連美倫生物科技有限公司)，色譜純甲醇(北京迪馬歐泰科技發展中心)，色譜純乙腈(北京迪馬歐泰科技發展中心)。

1.2方法

1.2.1動物模型 24只ICR小鼠適應性培養7 d，隨機分為鹽水對照組、鹽酸氯丙嗪實驗組，每組12只。實驗前一晚禁食，不禁水，灌胃前少量給食。實驗組給予鹽酸氯丙嗪120 mg/100 g灌胃；對照組給予等量生理鹽水灌胃，并于灌胃后1 h行頸椎脫臼處死。

1.2.2檢材處理 立即吸取死后小鼠腹主動脈血0.8～1.0 mL后放入肝素處理過的1.5 mL離心管內，4 ℃下以離心半徑8.5 cm，5 000 r/min離心5 min，取上清；然后再次離心，4 ℃下以離心半徑8.5 cm，12 000 r/min離心10 min，取上清100 μL與甲醇-乙腈混合液(甲醇∶乙腈=1∶1，V/V)按1∶3體積混合后震蕩，超聲10 min。于-20 ℃冰箱內靜置15 min，取上清，供UPLC-HRMS檢測。

1.2.3組織病理學檢查 取死后小鼠肝和腎組織浸入10%中性福爾馬林48 h后，經脫水、浸蠟、切片后常規蘇木素-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察兩組模型器官病理改變。

1.2.4UPLC-HRMS檢測色譜條件：本實驗采用Acquity HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm 1.8 μm；美國 Waters 公司)；柱溫40 ℃；流速 300 μL/min；流動相組成:A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸，洗脫梯度：0～1 min，2% B；1～3 min，2%～15%B；3～6 min，15%～50%B；6～9 min，50%～95%B；9～12 min，95%B；12.00～12.01 min，95%～2%B；12.01～15 min，2%B。進樣量:5 μL，進樣室溫度4 ℃。

質譜條件：采用HESI離子化方式；噴霧電壓：正極，3.0 kV；負極，2.7 kV。毛細管溫度320 ℃，加熱器溫度300 ℃；鞘氣流速：30 arb，輔助氣流速：15 arb;掃描模式為Full Scan/dd-MS2，采集范圍為70～1 500 m/z，正負離子切換采集模式；分辨率采用MS Full Scan 35 000 FWHM，MS2 17 500 FWHM，NCE為12.5 eV, 25 eV和37.5 eV。

1.3差異代謝物的篩選與鑒定 將原始數據導入 Compound Discovery 3.0(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行數據統計前預處理。處理后的數據上傳至MetaboAnalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)網站進行PCA及OPLS-DA分析，篩查出VIP>1的差異代謝物，并結合t檢驗(P<0.05)及差異倍數(fold change≥2或≤0.5)，進一步篩選出有統計學意義的差異代謝物。再將篩選結果通過與HMDB(https://hmdb.ca/)及mzCloud數據庫進行一級精確分子量及二級質譜碎片比對后進行核查，確定差異代謝物。

2 結 果

2.1組織病理學檢查 與對照組相比氯丙嗪急性中毒致死組肝組織可見肝細胞胞漿淡染及空泡變性，肝竇、肝板結構消失；腎組織腎小管腔內可見粉染淀粉樣細顆粒物，腎小球未見明顯異常(圖1)。

2.2代謝組學分析 通過PCA及OPLS-DA化學計量學模型對Compound Discovery 3.0預處理后數據進行分析。圖2A顯示24個樣本2 200多個代謝物經PCA建模后兩組樣本區分明顯。OPLS-DA模型(圖2B)顯示對照組與氯丙嗪急性中毒致死組樣本可明顯區分，100次置換檢驗(Q2=0.959，R2Y=0.991)顯示模型預測能力良好，且未出現過擬合現象(R2Y橫坐標值<1，圖2C)。

圖1 鹽酸氯丙嗪急性中毒致死小鼠肝、腎組織病理學變化(右上角為局部放大，HE染色 ×400)

2.3差異代謝物的篩選與鑒定 采用OPLS-DA 模型篩選出VIP>1的代謝物，再經t檢驗及差異倍數檢驗(fold change)(P<0.05,FC≥2或FC≤0.5)篩選出300多個差異代謝物，篩選代謝物結果以火山圖可視化呈現見圖3，FC(Fold Change)是各個樣本間表達量的比值，即差異倍數，橫坐標為以2為底、差異倍數的對數，縱坐標表示以10為底、t檢驗P值的對數，圖中紫色點為顯著性差異代謝物，黑色點為非顯著性差異代謝物。

圖3 鹽酸氯丙嗪急性中毒致死小鼠血漿差異代謝物火山圖

對篩選出的差異性代謝物進行在線數據庫匹配，鑒定出的差異代謝物及其參與的代謝通路匯總結果見表1。最終確定29個可能有生物學意義的差異代謝物，其中苯并噻嗪2個(外源性)，脂肪酰基9個，羧酸及其衍生物5個，咪唑并嘧啶3個，嘌呤核苷酸、吲哚及其衍生物、有機氮化合物各2個，酮酸及其衍生物、非金屬氧陰離子化合物、有機氧化合物、呋喃各1個。并對兩組差異性代謝物進行可視化聚類分析(圖4)。

表1 鹽酸氯丙嗪急性中毒致死小鼠血漿差異代謝物列表Table 1 List of differential metabolites in plasma of mice due to lethal acute poisoning with chlorpromazine hydrochloride

圖4鹽酸氯丙嗪急性中毒致死小鼠血漿差異代謝物熱力圖

3 討 論

醫源性藥物中毒死因判定一直是法醫工作者面臨的一個難題，而藥物與死亡發生之間的關聯性是中毒死亡判定中的難點。隨著代謝組學的發展，使獲取藥物中毒甚至致死后特征性內源性標志物成為可能。超高壓液相色譜-高分辨質譜聯用儀器在解決樣本成分分離基礎上大大提高了樣品成分相對分子質量檢測的準確度，是法醫毒物定性定量檢測的金方法，也是科研工作中強大的數據挖掘工具[15]。本研究通過分析小鼠鹽酸氯丙嗪中毒致死模型代謝物特點以篩選中毒死亡小鼠血漿差異代謝物，從而為人涉藥致死案例的證明及排除提供依據。

本研究檢測并鑒定出的29個差異代謝物中，除了氯丙嗪及產物丙嗪外，其他27個差異代謝物均為內源性代謝產物，涉及到的種類主要為脂肪酰基，羧酸及其衍生物，咪唑并嘧啶等。首先，在脂肪酰基類差異代謝物中，L-乙酰肉堿在脂肪酸氧化中可促進乙酰輔酶A進入哺乳動物線粒體基質，同時還具有神經保護作用[16]。通過3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶產生甲羥戊酸是膽固醇生物合成的限速酶[17]。因此，中毒致死組小鼠血漿L-乙酰肉堿含量降低，甲羥戊酸含量升高以及其他幾種脂肪酰類物質含量異常提示肝臟脂肪酸及膽固醇代謝異常，且流行病學研究也發現氯丙嗪是當時所有抗精神病藥物中最容易引起肝臟急性損傷的藥物[18]。羧酸及其衍生物差異代謝物中，非對稱性二甲基精氨酸是存在于血漿并參與蛋白修復過程的副產物，非對稱性二甲基精氨酸會干擾L-精氨酸產生一氧化氮，一氧化氮是內皮和心血管健康的關鍵化學物質，且與神經、心血管疾病相關[19]。同時，足夠高含量的甲基丙二酸可扮演酸原和生物毒素的角色，前者引起的酸中毒會直接產生心臟毒性以及一系列精神癥狀如：震顫、嗜睡和癲癇發作。其次，對所有這些代謝差異物中，非對稱性二甲基精氨酸、亞精胺是已定義的尿毒癥毒素，同時，血漿中磷酸鹽升高是腎透析患者的普遍癥狀，且與死亡風險的增加相關，而且腎臟功能的失代償所引起的K+、Ca2+異常會影響心臟電生理活動，甚至心源性猝死。最后，α-酮戊二酸、非對稱性二甲基精氨酸、5-甲氧基吲哚乙酸酯差異代謝物的升高與乙酰膽堿及胺類(多巴胺、γ-氨基丁酸、5-羥色胺)神經遞質代謝有關，結合單磷酸腺苷、磷酸、次黃嘌呤及鳥嘌呤參與的嘌呤代謝異常，從多方面體現了氯丙嗪作用于中樞系統后對機體神經體液調節的廣泛而又重要的干預效應。上述所篩選的代謝產物可為氯丙嗪中毒致死案例的鑒別提供理論和實踐依據。

本研究運用基于UPLC-HRMS技術的代謝組學方法，并應用 OPLS-DA分析結合t檢驗及差異倍數篩選出血漿中與鹽酸氯丙嗪中毒致死密切相關的29種潛在的差異代謝物，為今后法醫學鹽酸氯丙嗪中毒死因判定提供了研究基礎。