正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選桑籽中1-脫氧野尻霉素的提取工藝

呂志強(qiáng) 李 喬 閆海龍 徐 文 趙振寰 鞏麗麗 田景振▲

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東青島 266000；2. 青島酒店管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院總務(wù)處門(mén)診部，山東青島 266000；3.青島婦女兒童醫(yī)院康復(fù)科，山東青島 266000；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355

桑籽為桑科植物桑（Morus aLba L.）的成熟果實(shí)的種子，桑樹(shù)果實(shí)含籽量為2.8%。桑籽中含大量的脂類(lèi)、氨基酸及豐富的微量元素及類(lèi)黃酮物質(zhì)，具有降血糖、調(diào)血壓、調(diào)節(jié)植物神經(jīng)等功效。桑葚加工后的殘?jiān)写蟛糠譃樯Ｗ眩俗鳛轱暳贤猓湓谑称贰⑨t(yī)療工業(yè)方面仍存在極大開(kāi)發(fā)利用空間。目前已有學(xué)者對(duì)桑類(lèi)藥材降血糖活性成分及其作用機(jī)理進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)其降血糖活性成分為多羥基生物堿[1]，其中以1-脫氧野尻（1-deoxynojirimycin，DNJ）為代表的多羥基生物堿是其重要的成分[2]，能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性[3-4]，較好地調(diào)節(jié)血糖代謝指標(biāo)[5-6]，對(duì)于肝糖代謝的改善[7]、胰島素抵抗的降低[8]，都具有明顯的作用。但是相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)DNJ 的提取工藝如何最優(yōu)化卻鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸乙醇作為提取劑，應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)法比較不同提取條件對(duì)DNJ 提取率的影響，優(yōu)選出了最佳提取工藝，拓展了桑資源研究的領(lǐng)域，為研發(fā)新藥和保健食品提供了依據(jù)，并為相關(guān)課題的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

XP205 型十萬(wàn)分之一電子分析天平[瑞士梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]；L-2000 高效液相色譜系統(tǒng)（日本株式會(huì)社日立制作所）；L-2400 型紫外檢測(cè)器（日本株式會(huì)社日立制作所）；Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，中國(guó)北京迪科馬科技有限公司）；RE52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（中國(guó)上海亞榮生化儀器廠）；HWS24 雙列四孔型儀表恒溫水浴鍋 （中國(guó)上海樹(shù)立儀器儀表有限公司）；BS110S 型電子分析天平[德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 試劑與材料

桑籽（來(lái)源于山東省蠶業(yè)研究所，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)教授周鳳琴鑒定為桑科植物桑Morus aLba L.的成熟果實(shí)的種子[9]），樣品分裝后4℃貯存；DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品（上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，純度98%以上，生產(chǎn)批號(hào)：201103018）；乙腈（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20121013）； 芴甲氧酰氯（Fmoc-Cl）（分析純，上海晶純生化科技股份有限公司，純度99.7%，生產(chǎn)批號(hào)：39308）；冰乙酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，生產(chǎn)批號(hào)：2010308）；氫氧化鉀（分析純，上海桃浦實(shí)業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20090111）；硼酸（分析純，天津博迪化工股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20091002）；甘氨酸（Glycine，Gly）（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠，生產(chǎn)批號(hào)：20110107）；正己烷（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20121107）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品制備

桑籽經(jīng)正己烷脫脂后，精確稱(chēng)取5.0026 g，加0.03 mol/L 50%的鹽酸乙醇30 ml，80℃浸提1 h，提取兩次，合并濾液，旋蒸至無(wú)醇味，離心，取上清液定溶至50 ml 量瓶中，搖勻，精密吸取100 μl 于1 ml 容量瓶中，加去離子水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2 DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

精密稱(chēng)取DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品置于容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，配得質(zhì)量濃度0.491 mg/ml 的DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 DNJ 的測(cè)定方法

2.3.1 DNJ 的衍生操作過(guò)程 精密吸取“2.1”項(xiàng)下的50 μl 供試品溶液，與50 μl 的0.4 mol/L 的硼酸鉀緩沖溶液（pH 8.5）在試管中混合，然后加入100 μl 的5 mmol/L Fmoc-Cl 的乙腈溶液，迅速搖勻，在40℃水浴鍋中反應(yīng)20 min。加入50 μl 的0.1 mol/L 甘氨酸溶液中止反應(yīng)，再加入4%（v/v）乙酸水溶液200 μl，以生成穩(wěn)定的DNJ-Fmoc，經(jīng)0.45 μm 微濾膜過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析。

2.3.2 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相：乙腈-0.1%乙酸溶液（55∶5）；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20 μl；流速：1.0 ml/min[10]。

2.3.3 供試品衍生化液相峰的確定 分別取“2.1”項(xiàng)下的50 μl 的供試品溶液、“2.1”項(xiàng)下的50 μl 供試品加入“2.2”項(xiàng)下的50 μl 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別按照“2.3.1”項(xiàng)下的DNJ 的衍生操作方法處理，按照“2.3.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定（圖1、2）；另外，再設(shè)Fmoc-Cl 對(duì)照（圖3）和Gly 與Fmoc-Cl 絡(luò)合物對(duì)照（圖4），其中Fmoc-Cl 對(duì)照、Gly 與Fmoc-Cl 絡(luò)合物對(duì)照不加DNJ 標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過(guò)圖1、2 峰面積值比較，發(fā)現(xiàn)加入標(biāo)準(zhǔn)品后只有峰2 的峰面積增加明顯，峰2 為Fmoc-DNJ（Fmoc-Cl 與DNJ 反應(yīng)生成的絡(luò)合物）；通過(guò)圖1、2、3、4 之間比較，可以斷定峰3 為Fmoc-Gly；峰4 為Fmoc-Cl。

圖1 供試品溶液色譜圖

圖2 供試品+標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖

圖3 Fmoc-Cl 對(duì)照組圖譜

圖4 Gly 與Fmoc-Cl 絡(luò)合物對(duì)照組圖譜

2.3.4 線性關(guān)系的考察 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用去離子水稀釋?zhuān)謩e配制成4.91、9.82、14.73、19.64、24.55、29.46、34.37、39.28 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。衍生化后按“2.3.2”項(xiàng)下的色譜條件分別測(cè)定峰面積，并以色譜峰面積（Y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X）進(jìn)行回歸，二者的回歸方程為Y=4023.7X+2872.6，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9995。可見(jiàn)DNJ 的濃度在4.91～39.28 μg/ml 內(nèi)，其濃度和色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2 項(xiàng)”下的DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μl，衍生化后，重復(fù)測(cè)定6 份，測(cè)得峰面積RSD為1.777%。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μl，按上述測(cè)定方法分別于0、3、6、9、12、15 h時(shí)測(cè)定，在15 h 內(nèi)測(cè)得峰面積RSD=1.318%。

2.3.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 精密量取脫脂桑籽粉6 份，按“2.1項(xiàng)”下的供試品制備方法與“2.3.1”項(xiàng)下的DNJ 的衍生操作方法處理，按“2.3.2 項(xiàng)”下的色譜條件測(cè)定，測(cè)得DNJ 的平均含量為0.26%，RSD =2.027%。

2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的脫脂桑籽藥材粉末6 份，每份約0.3000 g，分別加入“2.2 項(xiàng)”下的DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品，按照“2.1”項(xiàng)下的供試品制備方法與“2.3.1”項(xiàng)下的DNJ 的衍生操作方法處理，精密吸取50 μl 進(jìn)行測(cè)定（表1）。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 DNJ 提取的單因素實(shí)驗(yàn)考察及結(jié)果

2.5.1 DNJ 提取率計(jì)算方法 精密稱(chēng)取已烘干脫脂桑籽粉為ml，DNJ 測(cè)定按照上述DNJ 的測(cè)定方法操作進(jìn)行，得m2，DNJ 提取率=m2×100/ml。

2.5.2 不同提取時(shí)間對(duì)桑籽中DNJ 提取率的影響 精密稱(chēng)取脫脂桑籽粉4 份，每份約5.0000 g，各加入0.03 mol/L 鹽酸-50%乙醇溶液30 ml，80℃分別浸提0.5、1、1.5、2 h，提取兩次，DNJ 的提取率依次為0.37%、0.38%、0.38%、0.38%。

2.5.3 提取次數(shù)對(duì)桑籽中DNJ 提取率的影響 精密稱(chēng)取脫脂桑籽粉4 份，每份約5.0000 g，各加入0.03 mol/L鹽酸-50%乙醇溶液30 ml，80℃浸提1 h，分別提取1、2、3、4 次，DNJ 的提取率依次為0.37% 、0.38% 、0.38%、0.37%。

2.5.4 不同溶劑量對(duì)桑籽中DNJ 提取率的影響 精密稱(chēng)取脫脂桑籽粉4 份，每份約5.0000 g，各加入0.03 mol/L鹽酸-50%乙醇溶液20、30、40、50 ml，80℃分別浸提1 h，提取兩次，DNJ 的提取率依次為0.37%、0.38%、0.38%、0.38%。

2.5.5 不同提取溫度對(duì)桑籽中DNJ 提取率的影響 精密稱(chēng)取脫脂桑籽粉5 份，每份約5.0000 g，各加入0.03 mol/L 鹽酸—50%乙醇溶液30 ml，分別在50、60、70、80、90℃分別浸提1 h，提取兩次，DNJ 的提取率依次為0.26%、0.32%、0.38%、0.38%、0.36%。隨提取溫度的增大，桑籽中DNJ 提取率逐漸增加，當(dāng)提取溫度為70℃與80℃，提取率最大，當(dāng)溫度繼續(xù)增大至90℃時(shí)，提取率降低，故溫度選擇70℃與80℃。

2.5.6 不同乙醇濃度對(duì)桑籽中DNJ 提取率的影響 精密稱(chēng)取脫脂桑籽粉4 份，每份約5.0000 g，各加入0.03mol/L鹽酸—10%、30%、50%、70%乙醇溶液30 ml，80℃浸提1 h，提取兩次，DNJ 的提取率依次為0.22%、0.28%、0.38%、0.34%。DNJ 提取率在乙醇濃度為50%時(shí)最大。

2.5.7 不同鹽酸濃度對(duì)桑籽中DNJ 提取率的影響 精密稱(chēng)取脫脂桑籽粉5 份，每份約5.0000 g，各加入0、0.01、0.03、0.05、0.07 mol/L 鹽酸-50%乙醇溶液30 ml，80℃浸提1 h，提取兩次，DNJ 的提取率依次為0.13%、0.20%、0.38%、0.40%、0.36%。隨鹽酸濃度的增加，桑籽DNJ 提取率逐漸增加，當(dāng)鹽酸濃度為0.05 mol/L時(shí)，提取率最大。

2.5.8 單因素方差分析 以提取率為因變量，影響因素1、2、3、4、5、6 對(duì)提取率的影響比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=1.496，P＞0.05）。影響因素1、2、3 的標(biāo)準(zhǔn)差較小，提取率比較接近；影響因素4、5、6 的標(biāo)準(zhǔn)差較大，提取率相差較大，故選擇取浸提溫度、乙醇濃度、鹽酸濃度3 個(gè)因素做進(jìn)一步的正交實(shí)驗(yàn)（表2、3）。

表2 描述性統(tǒng)計(jì)分析

表3 方差分析

2.6 DNJ 提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察，選取浸提溫度（℃）、乙醇濃度（%）、鹽酸濃度（mol/L）等3 個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3 個(gè)水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)考察（表4）。

表4 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

以DNJ 提取率作為指標(biāo)，按L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討最佳提取工藝條件，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6，以直觀分析和方差分析判斷各因素對(duì)DNJ 提取的影響程度，篩選最佳提取工藝。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析可見(jiàn)，3 個(gè)因素對(duì)DNJ提取率的影響程度依次為C＞B＞A。方差分析表明，因素C 影響最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。浸提溫度、乙醇濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較小。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)，考慮節(jié)能省時(shí)等因素，最后優(yōu)選桑葚籽中的DNJ 最佳提取工藝為C3B2A1。

2.7 提取工藝條件重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

為確認(rèn)上述工藝的穩(wěn)定性，按照工藝鹽酸濃度0.05 mo1/L，乙醇濃度50%，浸提溫度70℃，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。測(cè)得DNJ 的提取率（表7）。

表7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

我國(guó)桑資源豐富，桑籽具有降血糖、調(diào)血壓、調(diào)節(jié)植物神經(jīng)等功效，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究表明其降血糖活性成分為以DNJ 為代表的多羥基生物堿。本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目曾對(duì)桑籽中總生物堿、總多糖、總黃酮的提取進(jìn)行過(guò)研究，總生物堿的含量顯著高于總黃酮、總多糖[11]。目前對(duì)DNJ 的含量測(cè)定方法主要有柱前衍生-高效液相色譜法[12-14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法[16]、離子色譜測(cè)定法[17]。本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定DNJ 的含量，研究表明此測(cè)定方法重現(xiàn)性良好，相較于價(jià)格昂貴且較難配備的其他方法來(lái)說(shuō)具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)有效的顯著優(yōu)勢(shì)。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取時(shí)間、溶劑量、提取次數(shù)等通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；進(jìn)一步對(duì)鹽酸濃度、乙醇濃度及浸提溫度通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)方差分析，鹽酸濃度對(duì)DNJ 提取效果影響顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而由正交實(shí)驗(yàn)極差分析可知，鹽酸濃度對(duì)DNJ 提取效果影響最大，乙醇濃度次之，浸提溫度影響最小。綜合考慮各因素，確定了桑籽DNJ 最佳提取工藝參數(shù)為： 鹽酸濃度0.05 mo1/L、乙醇濃度50%、浸提溫度70℃。在此工藝條件下，桑葚籽DNJ 的提取率較高，為0.59%，與文獻(xiàn)報(bào)道的DNJ提取率比較相近[1]。此提取工藝參數(shù)的確定為進(jìn)一步拓展桑資源研究領(lǐng)域，研發(fā)新藥和保健食品，提供了依據(jù)。

因受研究周期所限，本實(shí)驗(yàn)所收集桑籽的品種、產(chǎn)地相對(duì)單一。而桑籽作為藥食同源的中藥，其DNJ的含量亦不同程度的受品種、種植基地和采摘時(shí)間等多種因素影響，下一步本課題將進(jìn)一步針對(duì)以上諸多影響因素進(jìn)行深入研究，以期篩選出合適的種植基地及品種，指導(dǎo)桑農(nóng)確定最佳采摘周期，為進(jìn)一步提升桑籽的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值及規(guī)模化生產(chǎn)提供依據(jù)。