鈣激活鉀通道在煙霧暴露所致大鼠血壓升高中的作用

劉燕鋒，王鳳曉，阮冬云，唐昱，張學洪，王云霞

1.江西省人民醫院，南昌大學附屬人民醫院，江西 南昌 330006；2.江西省第五人民醫院，江西 南昌 330046

吸煙是影響健康的一大危害因素，與心血管疾病的發生發展有著密切的聯系。吸煙可導致血管平滑肌（vascular smooth muscle，VSM）的損傷［1］，血管平滑肌損傷進一步導致血管功能紊亂。大電導鈣激活鉀通道（large-conductance calcium-activated potassium channels，BK 通道）廣泛分布于血管平滑肌細胞上，在血管舒縮功能調節方面起著重要作用［2-3］。本研究選取大鼠血管平滑肌細胞作為研究對象，探討吸煙對動脈血管平滑肌細胞及其BK 通道電流的影響，對吸煙引起血壓升高的具體機制進行深入的探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性Wistar 大鼠48 只，體質量200±20 g，購于醫科院動物所，動物合格證號0123009，飼養于清潔級動物房。

1.2 實驗器材及試劑

1.2.1實驗儀器小動物恒溫系統，小動物無創血壓測量系統（上海奧爾科特生物科技有限公司），倒置熒光顯微鏡，膜片鉗放大器（Axopatch 200B）及DigiData 1200B 型數/模（或模/數）轉換器（Axon，美國），03-D 玻璃微電極拉制儀。

1.2.2實驗試劑透明質酸酶、膠原酶、二硫蘇糖醇、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白（Sigma，美國）；乙二醇二乙醚二胺四乙酸、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（Germany），余試劑均為國產分析純。酶液Ⅰ：木瓜蛋白酶，1.75 mg/mL；二硫蘇糖醇，1.75 mg/mL；白蛋白，2.5 mg/mL。酶液Ⅱ：膠原酶Ⅰ，2.5 mg/mL；透明質酸酶，2.5 mg/mL；白蛋白，2.5 mg/mL。電極內液：KCl，40 mmol/L；K2Asp（天門冬氨酸鉀），100 mmol/L；MgCl2，1 mmol/L；EGTA，0.1 mmol/L；ATPNa2，4 mmol/L；HEPES（N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸），10 mmol/L。電極外液：NaCl，134 mmol/L；KCl，6 mmol/L；MgCl2，1 mmol/L；CaCl2，2 mmol/L；HEPES，10 mmol/L；葡萄糖，10 mmol/L。

1.3 大鼠模型建立與分組

煙霧暴露動物模型的建立：雄性Wistar 大鼠48只，按隨機數字表法分為對照組、煙霧暴露組，每組24 只，根據煙霧暴露時間，各組每個時間點6只大鼠。煙霧暴露組大鼠置于實驗性大鼠被動吸煙箱內進行模型制作，方案為：每天在特定時間使大鼠接受煙霧暴露1 次，每次暴露于10 支香煙的煙霧中，每次點燃2 支香煙，共分5 次點燃。香煙為市面上常規出售的香煙，焦油含量為13 mg/支，尼古丁含量為1.2 mg/支，分別煙霧暴露0、4、8、12 周，對照組除不進行煙霧暴露之外，其余處理相同。血壓測定采用無創血壓測量分析系統，每天于8:00-14:00 測定大鼠血壓水平，每只大鼠在安靜狀態下測血壓3 次，取平均值。煙霧暴露組大鼠血壓從第6 周開始升高，第12 周煙霧暴露組大鼠血壓較對照組血壓值增加40 mm Hg 以上，表明大鼠煙霧暴露所致高血壓模型的建立成功。

1.4 血壓測量方法

將大鼠尾動脈測壓儀開啟預熱20 min，進行大鼠血壓信號標測。據大鼠體量將其裝入固定盒內固定后，尾部插入加壓套近尾根部,使鼠尾剛好處于脈搏傳感器的“脈搏信號傳感片”上方，使鼠尾壓迫傳感片緊貼尾動脈,待大鼠脈搏穩定后進行血壓測量。

1.5 主動脈形態學檢測

以肝素抗凝，戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠斷頭處死，取出主動脈，于主動脈弓處選取血管組織，置入4%多聚甲醛中固定24 h，隨后行石蠟包埋，切片，HE 染色。光鏡下觀察對照組及煙霧暴露12周時大鼠血管形態變化。

1.6 大鼠主動脈血管平滑肌細胞的分離

在實驗第0、4、8、12 周，分離大鼠主動脈平滑肌細胞：戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取出胸主動脈,游離出血管中膜，依次放入酶液Ⅰ、酶液Ⅱ中進行消化，酶液I 消化時間為25 min，酶液Ⅱ為15 min，高倍鏡下觀察細胞懸液，每個視野可找到4～5 個膜完整且折光性好細胞，即可終止酶解，將細胞懸液放置于4 ℃冰箱保存。

1.7 膜片鉗全細胞BK 電流記錄方法

采用垂直玻璃微電極拉制儀兩步法拉制玻璃微電極，電極尖端阻抗4～7 MΩ,電極經拉制拋光后入液電阻4～7 MΩ,封接電阻＞1 GΩ，內充電極內液，NaOH 調pH 值至7.4。將分離出的VSMC 保存于無鈣臺氏液中，細胞懸液加于灌流槽中，待細胞貼壁后，電極外液1～2 mL/min 灌流15～20 min。電極入液，鉗制平滑肌細胞，負壓破膜，使細胞內液與電極內液完全相通，建立全細胞記錄后，使用pCLAMP 軟件（pCLAMP 9.0，Axon Instruments，USA）記錄細胞膜電容（Cm），隨后以放大器（Axopatch 200B，AxonInstruments，USA）的慢電容補償和串聯電阻補償，保持鉗制電位為-60 mV，給細胞施加去極化方法刺激，頻率0.2 Hz，持續時間為400 ms，從-50 mV 去極化至+70 mV，以激發外向鉀電流,觀察到電流基本穩定后，記錄電流。電流記錄在室溫條件（25 ℃）下進行。

1.8 統計學方法

以SPSS 17.0 軟件進行統計分析，采用重復資料測量的方差分析方法來分析大鼠血壓隨時間的變化趨勢，采用pCLAMP 9.0 軟件對膜片鉗記錄數據進行數據和圖形轉換，計量資料以表示，行t檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 煙霧暴露對大鼠血壓的影響

本實驗通過建立煙霧暴露動物模型，觀察煙霧暴露對大鼠血壓的影響。實驗結果表明（見圖1），煙霧暴露組第8～12 周血壓，較對照組明顯增高（P＜0.05）。

圖1 煙霧暴露對大鼠血壓的影響（n=6）

2.2 血管形態學變化

顯微鏡下可見對照組大鼠主動脈內皮完整，中膜平滑肌細胞排列規則（圖2-A）。煙霧暴露組大鼠主動脈壁增厚，內皮細胞下基質變厚，中膜的平滑肌層增厚，平滑肌細胞整體變短小（圖2-B），提示煙霧暴露使動脈平滑肌增生。

圖2 大鼠主動脈血管結構的光鏡觀察（HE×100倍）：A.對照組；B.煙霧暴露組

2.3 煙霧暴露對大鼠平滑肌細胞BK 通道電流密度的影響

在全細胞模式下，將膜電位鉗制在-60 mv，階躍刺激從-50 mv 開始，以10 mv 階躍去極化至+70 mv，持續400 ms，誘發出大鼠主動脈平滑肌細胞BK 電流（見圖3）。在實驗第0、4、8、12 周，使用全細胞膜片鉗記錄對照組及煙霧暴露組大鼠主動脈平滑肌細胞鈣激活鉀通道電流密度，煙霧暴露組BK 通道電流密度隨著煙霧暴露持續時間的增加而逐漸減低，對照組BK 通道電流密度無明顯變化。

圖3 煙霧暴露時間與大鼠平滑肌細胞膜BK通道電流密度的關系（n=6）

2.4 BK 電流密度-電壓（I/V）曲線測定

電壓鉗模式下，將膜電位鉗制在-60 mV，階躍刺激從-50 mV 開始，以10 mV 階躍去極化至+70 mV，持續400 ms，根據激活電位及相應的電流密度可得到I/V 曲線圖（圖4）。煙霧暴露組大鼠BK 通道電流密度在不同的時間點（0、4、8、12 周），不同的刺激電壓，電流變化的趨勢也不同（P＜0.05）。

圖4 大鼠主動脈平滑肌細胞BK電流密度-電壓（I/V）曲線（n=6）

3 討論

吸煙是導致血管相關疾病的重要原因之一，煙草煙霧中的有害物質可造成血管舒縮功能異常［4］。以往關于吸煙對血管功能影響的研究，多集中于血管內皮功能［5-6］。本實驗建立煙霧暴露大鼠模型，探討煙草煙霧暴露對大鼠血管平滑肌功能的直接影響。在我們的實驗中觀察到，煙霧暴露12 周，大鼠血管壁出現局部增厚，內皮細胞出現部分基質變厚，平滑肌層增厚，提示煙霧暴露會導致血管平滑肌增生。有研究表明，血管平滑肌細胞增殖可以影響大鼠血壓水平［7］。同時，我們監測大鼠血壓發現，第6 周開始，煙霧暴露組大鼠的血壓水平開始升高，并隨著煙霧暴露時間的延長而持續升高，提示煙霧暴露可能通過調節血管平滑肌舒縮功能而影響大鼠血壓水平。

血管平滑肌細胞在調節血管舒縮狀態中起到決定性的作用。在動脈平滑肌細胞膜上，BK 通道對血管舒縮功能的調節作用最為重要［8-9］。研究表明大鼠在長期寒冷刺激的環境下，胸主動脈平滑肌細胞BK 通道的活性下降［10-11］。BK 通道改變會直接影響血管張力。細胞內鈣離子濃度升高時，BK 通道被激活，產生鉀離子外流，從而導致細胞超極化，反饋性地抑制鈣離子通道開放，從而使血管擴張［12］。使用BK 通道特異性阻滯劑Iberiotoxin 阻滯BK 電流后，動脈明顯收縮，因此BK 通道對動脈血管張力也具有重要的調節作用［13］，煙草煙霧所致的血管張力及血壓水平的變化是否是導致血管平滑肌細胞BK 通道電流改變的結果尚不清楚。

有報道提出，煙霧暴露可以通過激活電壓依賴性Ca2+通道及誘導肌漿網內Ca2+釋放，增加細胞內Ca2+的濃度［14］，當細胞內Ca2+濃度升高時導致BK 通道開放，形成自發性一過性K+外流，引起細胞超極化使血管擴張，從而使肌張力盡量維持在一定水平［15］。在實驗中，我們觀察到煙霧暴露組大鼠血管平滑肌細胞鈣離子鉀通道電流及電流密度從第4 周時開始減低，且隨著煙霧暴露的時間延長而持續降低，同時血壓持續上升。結果表明，在長期煙霧暴露的條件下，血管平滑肌細胞BK 通道功能受損，對血管舒縮功能的反饋性調節作用減弱，從而使血壓隨煙霧暴露時間的延長而持續升高。

本實驗研究結果表明，煙霧暴露時，血管平滑肌細胞增殖，細胞內鈣離子濃度隨煙霧暴露時間的延長而升高，從而導致機體血壓的升高；而BK Ca2+通道電流作為一種調節血管舒張的反饋性的保護因素，隨煙霧暴露時間的延長而減低，血管舒縮功能障礙，進一步導致機體血壓升高。因此，在吸煙人群中，盡量阻斷或者減少香煙毒素對血管平滑肌BK的損傷，可能有助于降低吸煙人群高血壓的發病率，為吸煙人群心血管并發癥的防治提供了新的思路。