miR-329通過負性調節KDM1A抑制胃癌細胞增殖及侵襲的機制研究

田婉婷

胃癌是全球常見惡行腫瘤之一，據報道，2013年全球約有73.8萬人死于胃癌，胃癌患者預后差[1,2]。胃癌的臨床標志是異質性，從自發消退到快速疾病進展和死亡。盡管胃癌治療近期有治療效果改善，但整體5年生存率仍然很低。在診斷時，73%的胃癌患者已經發生惡性病變[3]。雖然已經發現多種遺傳和分子病變與胃癌發生有關，但是這種腫瘤的分子機制仍然知之甚少。微小RNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA分子，長度為19～25個核苷酸，通過靶向mRNAs在轉錄后調節基因表達[4]。miRNA與靶mRNA的30-非翻譯區(30-UTR)結合，導致mRNA的翻譯抑制或降解。此外，單個miRNA可以調節多個mRNA，單個mRNA也可以被許多miRNA靶向調控。miRNA可能作為癌癥的新治療策略，因為它們可以作為腫瘤抑制因子或依賴于靶mRNA的癌基因[5,6]。研究報道miR-329在肝癌、肺癌等癌組織和組織中顯著下調[7]。賴氨酸特異性脫甲基酶1(the 30-UTR of lysine-specific demethylase 1，KDM1A)是含有組蛋白去甲基化酶的KDM1家族成員。研究證實，KDM1A在腫瘤進展中起重要作用，KDM1A在人乳腺癌細胞系和原發性乳腺癌中的表達上調[8]；KDM1A可促進癌細胞的上皮-間質轉化(EMT)；KDM1A高表達導致EC細胞生長，球形成和侵襲能力受到促進。對于胃癌，研究表明KDM1A在胃癌中的表達顯著上升，而KDM1A的過表達可促進體外細胞的生長和轉移[9]。這些結果顯示KDM1A可能是胃癌中的腫瘤促進因子。然而，KDM1A在胃癌細胞中的調節機制以及與miR-329的關聯仍有待完全闡明。本研究探討miR-329通過負性調節KDM1A抑制胃癌細胞增殖及侵襲的機制，為胃癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與分組 本研究前期預試驗測定miR-329在NCI-N87、CRL-5822、BGC-823、HGC-27及胃正常上皮細胞中的表達情況，miR-329在BGC-823、胃正常上皮細胞中的表達有差異，在CI-N87、CRL-5822、HGC-27、胃正常上皮細胞表達無差異。故選擇BGC-823為研究對象。人胃腺癌細胞系(BGC-823)和獲自中南大學湘雅醫學院細胞中心，將所有細胞系在含有10%胎牛血清(FBS；thermo fisher)的DMEM(thermo fisher，carlsbad，CA，USA)中于37℃在含有5%CO2的潮濕培養箱中培養。

1.1.1 分組設計：BGC-823癌細胞組(轉染陰性對照 siRNA)：取10 ml BGC-823胃腺癌細胞液于10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于CO2培養箱(37℃、5% CO2、20% O2)；miR-329 mimics組、miR-329 inhibitor組：取10 ml轉染miR-329 mimics、miR-329 inhibitor的BGC-823胃腺癌細胞液于10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于CO2培養箱(37℃、5% CO2、2% O2)。以上各組每孔設6個平行樣，培養72 h。

1.1.2 BGC-823胃腺癌細胞陰性siRNA、BGC-823胃腺癌細胞miR-329 mimics、miR-329 inhibitor轉染：根據說明，使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)進行細胞轉染。用陰性siRNA(siRNA序列:5’-TUTGACTCAUTGCTTGACT-3’)、miR-329 mimics、miR-329 inhibitor轉染BGC-823胃腺癌細胞；具體步驟：取BGC-823胃腺癌細胞液接種于6孔板，取100 pmol的陰性siRNA、miR-329 mimics、miR-329inhibitor 于200 μl DMEM培養基中，取4 μl lipofectamine2000于200 μl DMEM培養基中，混勻lipofectamine2000和miRNA液，室溫培育30 min，無菌PBS洗滌細胞，將混合液加入細胞孔內，6 h 后棄混合液，加入胎牛血清的DMEM培養基培養，流式細胞儀檢測轉染效情況，取少許細胞采用流式細胞儀FACSCalibur檢測miR-329 mimics、miR-329inhibitor陽性細胞的百分比(檢測綠色熒光)，分別為90.23%、89.34%。見圖1。

圖1 miR-329 mimics、miR-329inhibitor轉染效率；A miR-329 mimics組；B miR-329 inhibitor組

1.2 BGC-823胃腺癌細胞增殖情況檢測及癌細胞單克隆形成數目檢測 將各組BGC-823胃腺癌細胞(5×104)接種到96孔板中，并向每個孔中加入100 μl含有0.5 g/L MTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的新鮮無血清培養基。在37℃下孵育0、24、48和72 h后，除去培養基。然后向每個孔中加入50 μl DMSO(Sigma-Aldrich)并在37℃下孵育10 min。使用平板讀數器(TECAN Infinite M200，Switzerland)測量每個樣品的A570。轉染24 h后，將細胞用胰蛋白酶處理，計數，并在密度為1 000個細胞/孔的6孔板中用完全培養基重新接種8 d。每3天更換培養基以維持細胞生長。將菌落固定并用0.5%結晶紫(Sigma，St Louis，MO，USA)在室溫下染色30 min。培養8 d后，在倒置顯微鏡下計數菌落數。

1.3 BGC-823胃腺癌細胞凋亡情況檢測 使用膜聯蛋白-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Roche，Basel，Switzerland)根據制造商的說明書檢測細胞凋亡。通過胰蛋白酶消化收集各組BGC-823胃腺癌細胞，在PBS中洗滌2次，并重懸于500 μl 1’結合緩沖液中，然后加入5 μl膜聯蛋白V-FITC和5 μl PI。在室溫下在黑暗中孵育10 min后，用流式細胞儀(C6; BD Biosciences)分析熒光。

1.4 BGC-823胃腺癌細胞細胞周期檢測 將BGC-823胃腺癌細胞(1×106)用DPBS洗滌2次，重懸于70%乙醇中，并在-20℃下固定過夜。然后將細胞在含有3%BSA的PBS中洗滌2次，并在室溫下在含有3%BSA，40 μg/ml PI和0.2 mg/ml RNase的PBS中的碘化丙啶(PI)染色緩沖液中孵育30 min。使用流式細胞儀(C6；BD Biosciences，San Jose，CA，USA)進行細胞周期分析。

1.5 Transwell 細胞遷移實驗 加入100 μl稀釋的MatrigelTM(1 mg/ml，BD Biosciences，China)后，將上部Transwell室置于37℃下4～5 h，以使MatrigelTM產生凝膠。在轉染后48 h，將200 μl體積的2×105個BGC-823胃腺癌細胞加入6.5 mm Transwell室中，向下室中加入補充有10%FBS的RPMI1640培養基。然后將細胞在37℃培養箱中培養24 h。24 h后用甲醇將細胞固定15 min，用0.1%結晶紫染色40 min，并用光學顯微鏡計數，計數每個視野內穿過8 μm微孔的細胞數。

1.6 BGC-823胃腺癌細胞miR-329、KDM1A mRNA水平測定 使用TRIzol Reagent(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)從細胞系中提取總RNA，然后根據制造商的說明書使用Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher)將其轉化為cDNA。使用PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒(Takara，Tokyo，Japan)在ABI 7300 plus熱循環儀(Thermo Fisher)上進行miR-329、KDM1A mRNA表達檢測。U6用作內部參考。使用標準SYBR-Green RT-PCR試劑盒(Takara)檢查mRNA表達。使用的引物如下：miR-329,5’-GGGGCCAGTTC

TTGGTCAA-3’(正向)和5’-TTGGGCACCGAATGTTCA

ATC-3’(反向)；KDM1A 5’-TCCGAAGGTGTACCTCAA

C-3’(正向),Reverse 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(反向)U6，5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’(正向)和5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’(反向)。反應條件為95℃ 3 min，然后進行40個循環，95℃ 30 s和60℃ 30 s。通過2-ΔΔCt方法分析相對表達。

1.7 BGC-823胃腺癌細胞Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9蛋白水平測定 染毒結束后，5 000 r/min離心收集各組細胞，常規WEST-BLOT法測定KDM1A、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9蛋白水平。

2 結果

2.1 3組BGC-823癌細胞OD值、存活率比較 miR-329 mimics組OD值、存活率低于BGC-823癌細胞組(P<0.05)，miR-329 inhibitor組OD值、存活率高于BGC-823癌細胞組和miR-329 mimics組(P<0.05)。見表1。

表1 3組BGC-823癌細胞OD值、存活率比較

2.2 3組BGC-823癌細胞單克隆形成數目比較 miR-329 mimics組克隆形成數目低于BGC-823癌細胞組(P<0.05)，miR-329 inhibitor組克隆形成數目高于BGC-823癌細胞組和miR-329 mimics組(P<0.05)。見表2。

表2 3組BGC-823癌細胞克隆形成數目比較

2.3 3組BGC-823癌細胞凋亡率、G1期、穿膜數比較 miR-329 mimics組細胞凋亡率、G1期高于BGC-823癌細胞組，miR-329 inhibitor組細胞凋亡率、G1期低于BGC-823癌細胞組和miR-329 mimics組(P<0.05)。miR-329 mimics組細胞穿膜數低于BGC-823癌細胞組，miR-329 inhibitor組穿膜數高于BGC-823癌細胞組和miR-329 mimics組(P<0.05)。見表3，圖2、3。

圖2 3組BGC-823癌細胞凋亡率比較;A BGC-823癌細胞組；B miR-329 mimics組；C miR-329 inhibitor組

表3 3組BGC-823癌細胞凋亡率、G1期、穿膜數比較

2.4 3組BGC-823癌細胞miR-329、KDM1A mRNA表達比較 miR-329 mimics組miR-329 mRNA表達高于BGC-823癌細胞組，KDM1A mRNA表達低于BGC-823癌細胞組(P<0.05)，miR-329 inhibitor組miR-329 mRNA低于BGC-823癌細胞組和miR-329 mimics組，KDM1A mRNA表達高于BGC-823癌細胞組和miR-329 mimics組(P<0.05)。見表4。

BGC-823癌細胞組 miR-329 mimics組 miR-329 inhibitor組

表4 3組BGC-823癌細胞miR-329、KDM1A mRNA表達水平比較

2.5 3組BGC-823癌細胞KDM1A、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9蛋白表達比較 miR-329 mimics組KDM1A 蛋白表達低于BGC-823癌細胞組(P<0.05)，miR-329 inhibitor組KDM1A 蛋白表達高于BGC-823癌細胞組和miR-329 mimics組(P<0.05)。miR-329 mimics組Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9蛋白表達高于BGC-823癌細胞組(P<0.05)，miR-329 inhibitor組Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9蛋白表達低于BGC-823癌細胞組和miR-329 mimics組(P<0.05)。見表5。

表5 3組BGC-823癌細胞KDM1A、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9蛋白表達水平比較 n=6,分,

2.6 各變量的相關性分析 miRNA-329與KDM1A負相關關系明顯，與Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9正相關關系明顯(P<0.05)。見圖4，表6。

圖4 3組KDM1A、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9蛋白表達比較;A BGC-823癌細胞組；B miR-329 mimics組；C miR-329 inhibitor組

表6 各變量的相關性分析

3 討論

微小RNA在腫瘤生物學的多個方面發揮重要作用。有研究報道，不同腫瘤中miR-329的下調與侵襲性進展和預后不良有關；miR-329在膠質瘤中下調，并通過調節E2F1介導的Akt通路抑制來促進膠質瘤細胞的增殖；MiR-329通過靶向作用CD146抑制血管生成，CD146是一種在病理性血管生成過程中異常上調的內皮生物標志物，并作為血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)的共同受體促進疾病進展[10]；miR-329在介導肽聚糖(PDG)誘導的滋養細胞凋亡和通過靶向NF-rB亞基p65抑制IL-6表達中起重要作用；miR-329通過靶向作用于人膀胱癌中的RAP2B抑制增殖，遷移和侵襲；miR-329可作為預后標志物，通過直接抑制MAP4K4的表達來調節肝癌的進展[11,12]；miR-329通過靶向作用蛋白酪氨酸磷酸酶非受體12型抑制卵巢癌細胞的生長，遷移和侵襲。更重要的是miR-329的外源性表達可抑制胃癌細胞遷移，侵襲和胃癌細胞的上皮-間質轉化表型，認為miR-329通過靶向FoxM1作為腫瘤抑制因子。這些數據提供了強有力的證據表明[13,14]。本研究結果顯示，miR-329過表達在BGC-823癌細胞中能抑制其存活率、克隆形成數目、穿膜數，并促進BGC-823癌細胞凋亡，反之，miR-329低表達在BGC-823癌細胞出現相反的結果，同時也提示，miR-329可抑制胃癌細胞增殖及侵襲。

KDM1A有助于多種癌癥的發生。有研究報道，KDM1A在結直腸癌中高表達，而KDM1A敲除的結腸直腸癌細胞的致瘤性較低，且KDM1A通過激活Wnt/b-連環蛋白信號通路促進結直腸腫瘤發生；KDM1A高表達與食管鱗狀細胞癌預后不良有關，可能作為潛在的預后因素[15]；在前列腺癌中，KDM1A的表達與VEGF-A和cyclin A1的表達有關，這是調節血管生成和腫瘤侵襲的關鍵因素；KDM1A的陽性表達和E-鈣粘蛋白的陰性表達與結腸癌的不良預后相關；KDM1A的缺失抑制了結腸癌細胞的生長。目前多項研究探討了miR調節KDM1A的潛在機制。研究發現，miR-29a在前列腺癌細胞中的強制表達抑制了增殖，并通過抑制KDM1A的表達誘導細胞凋亡[16]；miR-137通過靶向KDM1A作為前列腺癌發生和進展的腫瘤抑制因子[17-19]；乳腺癌細胞中KDM1A沉默與hsa-miR-448的上調相關，并導致MALAT1表達的抑制，體外遷移、侵襲和克隆形成能力下降。上述觀點表明KDM1A可能是許多不同miRNA的靶標。本研究結果顯示，miR-329 mimics組miR-329 mRNA表達高于BGC-823癌細胞組，KDM1A mRNA表達低于BGC-823癌細胞組，miR-329 inhibitor組miR-329 mRNA低于BGC-823癌細胞組，KDM1A mRNA表達高于BGC-823癌細胞組，miR-329 inhibitor組miR-329 mRNA表達低于miR-329 mimics組，KDM1A mRNA表達高于miR-329 mimics組；且miRNA-329與KDM1A呈負相關，這與上述討論符合，同時也說明miR-329可抑制KDM1A的表達。本研究同時發現，miR-329 mimics組Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9蛋白表達高于BGC-823癌細胞組，而miR-329 inhibitor組上述蛋白表達低于BGC-823癌細胞組和miR-329 mimics組。提示miR-329通過抑制KDM1A的表達導致Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9高表達進而抑制胃癌細胞的增殖及侵襲。

綜上所述，miR-329可抑制胃癌細胞增殖及侵襲，其機制與miR-329可能通過抑制KDM1A的表達導致Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9高表達有關。