食品中金黃色葡萄球菌定量檢驗能力驗證的質量控制

雷蘭蘭 康婕 王瑛 鄭玉紅 郭玉凡 張曼

摘 要：能力驗證是利用實驗室間比對評價實驗室校準或檢測能力的重要手段，合理的質量控制是確保能力驗證檢測結果準確性的關鍵。本文分別從試劑耗材、操作過程、儀器設備、人員及環(huán)境等5個方面對食品中金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證的影響因素和關鍵環(huán)節(jié)進行分析，以期為食品微生物實驗室能力驗證的質量控制提供參考。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌;能力驗證;質量控制

Quality Control of Proficiency Testing for Quantitative Testing of Staphylococcus aureus in Food

LEI Lanlan， KANG Jie， WANG Ying， ZHENG Yuhong， GUO Yufan， ZHANG Man

（Shaanxi Province Product Quality Supervision and Inspection Institute， Xi’an 710048， China）

Abstract： Proficiency testing is an important method to evaluate laboratory calibration or testing ability by using inter-laboratory comparison. Reasonable quality control is the key to ensure the accuracy of proficiency testing test results. In this paper， the influencing factors and key links of proficiency testing for quantitative detection of Staphylococcus aureus in food are analyzed from five aspects： reagent consumables， operation process， equipment， personnel， and environment， so as to provide reference for the quality control of food microbiology laboratory proficiency testing.

Keywords： Staphylococcus aureus; proficiency testing; quality control

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染，也是常見的食源性致病菌，一旦食物保存不當，金黃色葡萄球菌可大量繁殖，可引起食物中毒。在《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》

（GB 29921—2021）[1]里的13類食品中有8類食品對金黃色葡萄球菌的指標作出了限量要求，《食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量》

（GB 31607—2021）[2]的3類食品均對該菌的指標作出了限量要求。

近年來，隨著我國對食品安全問題重視程度的增加，對食品檢驗檢測機構的能力要求也越來越高。能力驗證（Proficiency Testing）是利用實驗室間比對來判定實驗室和檢查機構能力的活動，也是認可機構加入和維持國際相互承認協(xié)議（MRA）的必要條件之一。對于已經(jīng)獲得或者申請CNAS認可的實驗室，參加能力驗證活動是強制性的，《能力驗證領域和頻次表》（CNAS-AL07-CNAS）中要求食品微生物領域每年至少參加一次能力驗證[3]。作為微生物致病菌指標之一，金黃色葡萄球菌也是食品微生物能力驗證考核常見的一個項目。參加者收到的樣品一般為白色凍干塊狀，需要按照作業(yè)指導書要求，用一定體積的無菌水或無菌生理鹽水再水化后，再按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）[4]第2法金黃色葡萄球菌平板計數(shù)法進行檢驗，該檢驗方法的操作步驟包括樣品的水化、系列稀釋、接種、培養(yǎng)、典型菌落計數(shù)、結果計算以及報告。實驗過程中不但包括典型及可疑菌落計數(shù)，還包括目標菌的鑒定，在實驗過程中有各種細節(jié)問題需要注意，因此具有一定的難度。所以為了得到滿意的能力驗證結果，需要從接到樣品到接下來的實驗過程中始終貫穿合理的質量

控制。

1 作業(yè)指導書

不同于普通食品，為了保證均勻性和穩(wěn)定性，參加者接收到的能力驗證樣品一般為凍干粉，并隨附一份作業(yè)指導書，用于規(guī)范檢驗前后的一些事項操作過程，如樣品的保存、水化、檢驗以及結果報告。因此參加者收到能力驗證樣品后首先應該仔細研讀作業(yè)指導書，如果不能及時檢驗，先將樣品按照作業(yè)指導書的要求進行冷藏或者冷凍保存，及時按照作業(yè)指導書的要求準備水化試劑和檢驗試劑，檢驗完成后在規(guī)定的時限內按照作業(yè)指導書規(guī)定的方式進行結果的填報。

2 試劑耗材

2.1 試劑

樣品水化及檢測過程中用到的培養(yǎng)基等試劑要按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質量要求》（GB 4789.28—2013）[5]，經(jīng)過生長率、特異性以及選擇性的驗證，配制好的培養(yǎng)基及試劑要在規(guī)定的時間內使用。特別需要注意的是涂布用的Baird-Parker瓊脂平板在制備凝固后，應放在超凈工作臺上，打開皿蓋，開啟風機，吹風2～

4 h，讓平板盡量干燥，加入樣液后也才能更好地吸收[6]。不符合標準要求或者使用過期的試劑和培養(yǎng)基等都會導致結果的偏離。

2.2 耗材

金黃色葡萄球菌檢驗過程中使用的耗材包括無菌袋或者無菌瓶、吸管或者吸頭、試管、平皿、涂布棒和接種環(huán)等。這些耗材中一次性使用的包括無菌袋、塑料吸管、吸頭、平皿、涂布棒及接種環(huán)等，在生產過程中已經(jīng)過化學或者物理方式的消毒滅菌處理，并且在出廠銷售前經(jīng)過消毒劑殘留分解的過程，但是檢驗員在接收到這類耗材時，仍然需要對其進行消毒劑殘留抑菌驗證以及無菌驗證，以防止使用消毒劑殘留超標或者非無菌的耗材造成能力驗證結果的偏離。對于非一次性耗材，如無菌瓶、玻璃吸管、玻璃試管、玻璃平皿及玻璃涂布棒等，每次使用完成后，應清洗晾干，以備下次使用。使用這類耗材時需要注意的是，在清洗過程中是否使用洗滌劑，清洗過程是否刷洗干凈，如果使用洗滌劑之后沒有用清水涮洗干凈，若存在洗滌劑的殘留，在檢測過程中會對微生物生長產生抑制作用，導致最終檢測結果出現(xiàn)偏離。

3 操作過程

3.1 樣品的水化

樣品的水化過程應該嚴格按照作業(yè)指導書的要求進行操作，主要過程包括溶解、反復清洗西林瓶及回收清洗液。水化過程是整個檢測過程的第一個環(huán)節(jié)，對最終的檢測結果有較大影響，加樣品水化所用的稀釋劑種類和體積是否正確，樣品是否完全溶解水化，水化后的溶液是否完全轉移，樣品在水化后是否充分混合均勻，樣品水化完成后是否立即按照標準要求進行檢測等，這些過程中的任何不規(guī)范操作都會導致結果的偏離。

3.2 樣品的稀釋過程

對于液體樣品，在稀釋過程中，標準要求首先取25 mL樣品原液，加入225 mL稀釋劑中混合均勻，制成1∶10的樣品勻液，再從1∶10的樣品勻液中取1 mL注入盛有9 mL稀釋劑的試管中混合均勻，制成1∶100的樣品勻液，按照上述1+9這樣的操作程序繼續(xù)操作，制成1∶1 000、1∶10 000等10倍系列稀釋樣品勻液。對于定量檢測，系列稀釋過程對于檢測結果有著非常重要的影響，個別檢驗員可能認為同樣是10倍稀釋，在第一次稀釋時就直接取1 mL樣品原液注于盛有9 mL稀釋劑的試管中制成1∶10的樣品勻液，但是在檢測過程中，取樣量越大，代表性也越強，檢測結果也越準確，所以取

1 mL樣品原液進行系列稀釋的非標準操作也會造成結果的偏離。

3.3 樣品接種

接種過程是否按照標準要求取1 mL樣品勻液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量進行加樣，涂布過程是否均勻涂布整個平板，涂布過程中涂布棒是否觸及平板邊緣。加樣量錯誤、涂布不均勻或者涂布時觸及平板邊緣也會導致結果偏離。

3.4 培養(yǎng)

平板倒置培養(yǎng)前，需要注意平板上的樣液是否被完全吸收，如果樣液未被完全吸收，倒置后未被吸收的樣液可能會流出平板，最終導致計數(shù)結果偏低。培養(yǎng)過程中的溫度和培養(yǎng)時長是否按照標準進行，不符合要求的培養(yǎng)溫度和時長會導致菌落不能正常生長或菌落形態(tài)不夠典型，從而導致計數(shù)結果的偏離。

3.5 典型菌落計數(shù)和確認

標準中描述了金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板和血平板上的各種形態(tài)特征，要求選擇Baird-Parker平板上有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3個平板所有菌落數(shù)合計在20～200 CFU的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)，從典型菌落中至少選取5個可疑菌落進行鑒定試驗。鑒定試驗包括染色鏡檢、血漿凝固酶試驗以及血平板培養(yǎng)菌落形態(tài)觀察。這個過程中包括典型菌落的辨別、計數(shù)及鑒定。是否能夠正確地識別典型菌落和可疑菌落的形態(tài)，是否按照標準要求進行菌落的計數(shù)，進行鑒定試驗的可疑菌落形態(tài)是否具有代表性，染色鏡檢試驗使用的培養(yǎng)物是否新鮮和染色操作步驟是否正確，血漿凝固酶試驗是否使用標準菌株進行陽性和陰性對照試驗，試驗過程中是否在規(guī)定的時間內進行觀察，觀察過程中是否輕拿輕放，血平板上菌落形態(tài)的觀察是否正確。這個環(huán)節(jié)也是樣品檢測過程中重要的一步，尤其是對于加有干擾菌的樣品，干擾菌的存在會影響檢驗員對可疑菌落的辨認和計數(shù)，從而造成結果的偏離。

3.6 結果計算和報告

標準中描述了共計5個類別的計數(shù)形式和2個計算公式。在這一步中檢驗員首先需要識別清楚平板計數(shù)的結果應該屬于5個類別計數(shù)形式的哪一種，然后按照該類別的要求使用相應的計算公式進行結果計算，最終按照標準要求報告結果，如果檢驗員對標準的該部分不能完全理解，則不能正確地選擇計數(shù)形式和計算公式，從而造成結果的偏離。

4 儀器設備

金黃色葡萄球菌定量檢驗過程中使用的關鍵設備主要有高壓滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、干熱滅菌箱，這3種設備都屬于溫控設備，需要對其進行溫度的準確性、穩(wěn)定性和均勻性的設備性能驗證，不符合標準要求的設備。例如高壓滅菌鍋可能會造成鍋內培養(yǎng)基等試劑的過度滅菌或者滅菌不充分，不符合要求的生化培養(yǎng)箱則會造成箱內培養(yǎng)的微生物不能正常生長，不符合要求的干熱滅菌箱也會造成箱內的器皿滅菌不夠充分或者對器皿造成破壞，最終造成結果出現(xiàn)偏離。

5 人員

從事微生物檢驗的人員應該具有相應的微生物專業(yè)教育或培訓經(jīng)歷，具備相應的資質，能夠理解并正確實施檢驗。無相應檢驗資質或者能力經(jīng)驗欠缺的人員可能對作業(yè)指導書以及檢驗標準理解不夠充分，從而在樣品水化、系列稀釋、接種、培養(yǎng)、計數(shù)確認及計算結果報告等過程中出現(xiàn)不規(guī)范操作，從而造成結果的偏離。

6 環(huán)境

金黃色葡萄球菌屬于致病菌，而能力驗證定量檢驗樣品中含有大量的活菌，因此實驗中涉及活菌操作的過程應該在二級生物安全實驗室進行，以防對樣品、實驗人員以及環(huán)境產生危害。

7 結語

影響金黃色葡萄球菌定量檢驗能力驗證結果準確性的因素主要有人員、設備、試劑、環(huán)境條件、樣品前處理和所采用的方法等。因此，在整個實驗過程中需按照作業(yè)指導書和檢驗標準的要求，嚴格控制實驗條件，保證使用的儀器處于良好的工作狀態(tài)，使用的培養(yǎng)基等試劑通過驗證，以及檢測人員具備相應的能力等，保證能力驗證工作獲得滿意的考核結果。

參考文獻

[1]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會和國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量：GB 29921—2021[S].北京：中國標準出版社，2021.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會和國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量：GB 31607—2021[S].北京：中國標準出版社，2021.

[3]陳歡.談談參加食品微生物學能力驗證的體會[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（2）：441-442.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 食品微生物檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗：GB 4789.10—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[5]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品微生物檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質量要求：GB 4789.28—2013[S].北京：中國標準出版社，2013.

[6]雷蘭蘭.食品微生物能力驗證的重要因素[J].現(xiàn)代食品，2018（12）：4-6.

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