酶法提取餐廚垃圾蛋白質(zhì)工藝研究

吳 偉，楊 軍,2，毛燕寧

(1.蘭州交通大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，甘肅 蘭州 733000；2.甘肅省黃河水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 733000)

1 引言

餐廚垃圾與其他垃圾相比，具有含水量、有機(jī)物含量、油脂含量及鹽分含量高，營(yíng)養(yǎng)元素豐富等特點(diǎn)，具有很大的資源化利用價(jià)值[1]。我國(guó)餐廚垃圾產(chǎn)生量大且實(shí)際處理能力不超過(guò)1.4 萬(wàn)t/d，日處理率不到6%，中國(guó)每年餐廚垃圾產(chǎn)量超過(guò)美國(guó)、日本和韓國(guó)總和的3 倍以上[2]，中國(guó)餐廚垃圾的問(wèn)題特別突出且亟需解決。

餐廚垃圾主要為蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、木質(zhì)纖維素等各種大分子有機(jī)聚合物組成，富含鉀、鈣、鎂等一些微量元素，具有很高的回收利用價(jià)值[3]。我國(guó)餐廚垃圾的組成復(fù)雜，傳統(tǒng)的方式并不能對(duì)其進(jìn)行有效的處理，尋找一種高效無(wú)害化、深度資源化的餐廚垃圾處理方法具有重要的意義[4]。

目前，酶的應(yīng)用日益廣泛，主要是在生物燃料生產(chǎn)、食品改性、洗衣、生物醫(yī)學(xué)、藥物研究和農(nóng)業(yè)工業(yè)廢物轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域[5～7]。G-Bustos用纖維素酶降解餐廚垃圾，有不錯(cuò)的效果[8]，I Imaim利用纖維素酶降解餐廚垃圾，酶解糖化率約30%[9]。J Niu也利用纖維素酶降解餐廚垃圾后，酶解糖化率達(dá)到36%[10]。呂健用纖維素酶對(duì)餐廚垃圾進(jìn)行酶解[11]，朱振新采用不同蛋白酶搭配，降解模擬餐廚垃圾，均有良好效果[12]。

研究以餐廚垃圾為原料，采用蛋白酶提取餐廚垃圾中的蛋白質(zhì)，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，探求酶解法提取餐廚垃圾蛋白質(zhì)的最佳工藝條件，旨在更好利用餐廚垃圾資源，開(kāi)發(fā)具有高附加值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，推動(dòng)國(guó)內(nèi)酶解提取餐廚垃圾中蛋白質(zhì)，在最大程度上對(duì)餐廚垃圾進(jìn)行資源化利用。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

餐廚垃圾：實(shí)驗(yàn)所采用的餐廚垃圾分別按照(質(zhì)量分?jǐn)?shù))30%的米飯、10%的辣椒、10%的白菜、10%的雞胸肉、10%的豆腐和豆皮、30%的食用油配置而成。其中，米飯取自于學(xué)校食堂，辣椒、白菜、雞胸肉、豆腐和豆皮、食用油來(lái)自于學(xué)校附近的菜市場(chǎng)，將上述樣品用粉碎機(jī)打碎，之后置于4 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

酶制劑：木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2 儀器與設(shè)備

雷磁PHS-3C型臺(tái)式pH計(jì)：山東省濟(jì)南市歷城區(qū)博科集團(tuán)總部；TG16 臺(tái)式高速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；歐萊博OLB-WB26恒溫水浴鍋：濟(jì)南童鑫生物科技有限公司；高速粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 酶解過(guò)程

稱取打碎的餐廚垃圾10 g，加入50 mL的蒸餾水，按照料液比1∶5比例進(jìn)行混合均勻，加入一定量的蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后，放入沸水浴中滅活15 min，然后冷卻10 min，在4000 r/min離心20 min，然后取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。

2.3.2 蛋白質(zhì)的測(cè)量

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)[13]。

蛋白質(zhì)提取率=(酶解后的蛋白質(zhì)濃度-酶解前的蛋白質(zhì)濃度)/酶解后的蛋白質(zhì)濃度

2.3.3 酶解單因素實(shí)驗(yàn)

以蛋白質(zhì)提取率為考察指標(biāo)，選擇初始溫度、pH值、酶解時(shí)間和酶加量4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

2.3.4 酶解動(dòng)力學(xué)的研究

為了預(yù)測(cè)和控制酶解過(guò)程中餐廚垃圾水解效果，提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量對(duì)酶解餐廚垃圾提取蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。

(1)

式(1)中，v為反應(yīng)速率，mg/h；[S]為底物濃度，mg/L；Vmax為最大反應(yīng)速率，mg/h；Km為米氏常數(shù)。

2.3.5 固態(tài)蛋白質(zhì)提取研究

固態(tài)蛋白質(zhì)分離沉淀最常用的方法就是等電點(diǎn)沉淀法。從試驗(yàn)中獲得的上清液稱為蛋白質(zhì)溶液。從6個(gè)燒杯中取出100 mL蛋白質(zhì)溶液，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH。然后將蛋白質(zhì)溶液放入-4 ℃的冰箱冷藏1.5 h，以8000 r/min離心20 min對(duì)固體蛋白質(zhì)進(jìn)行提取。

3 結(jié)果與分析

3.1 單一酶種類篩選

由表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：木瓜蛋白酶對(duì)餐廚垃圾中蛋白質(zhì)的提取率最高，為35.50 %，其次分別為菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶，堿性蛋白酶，提取率分別為34.16%，22.14%，19.31%，木瓜蛋白酶對(duì)餐廚垃圾中蛋白質(zhì)提取效果最好，其次是菠蘿蛋白酶和中性蛋白酶，堿性蛋白酶的提取效果較差，因此，選用木瓜蛋白酶作為單一酶提取餐廚垃圾中的蛋白質(zhì)。

表1 蛋白酶種類的篩選

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 pH值對(duì)粗蛋白提取率的影響

當(dāng)pH值等于或接近該酶的最佳活性pH值時(shí)，可獲得較好的酶解效果。從圖1可以看出，隨著pH值的升高，粗蛋白提取率呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明木瓜蛋白酶在酶解餐廚垃圾的過(guò)程中，最適pH值在4附近，隨著pH值的增加，酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶失活。因此，最適酶解pH值為4.0。

圖1 pH值對(duì)粗蛋白提取率的影響

3.2.2 溫度對(duì)粗蛋白提取率的影響

從圖2可以看出，隨著溫度的增加，粗蛋白提取率先增加后減少。當(dāng)溫度小于40 ℃時(shí)，粗蛋白提取率呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明由于溫度過(guò)低，未達(dá)到木瓜蛋白酶作用的最適溫度；當(dāng)溫度大于40 ℃，粗蛋白提取率迅速下降，并且在80 ℃，粗蛋白提取率達(dá)到最低，與最高的蛋白質(zhì)提取率相差44.87%，由于酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，引起蛋白質(zhì)變性，致使酶失活，從而降低反應(yīng)速率，后面蛋白質(zhì)的釋放，僅僅依靠水解進(jìn)行。因此，確定最佳酶解溫度為40 ℃。

圖2 溫度對(duì)粗蛋白提取率的影響

3.2.3 酶解時(shí)間對(duì)粗蛋白提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)酶解時(shí)間為0～1 h時(shí)，粗蛋白提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明在該時(shí)間段酶解反應(yīng)還未達(dá)到適宜條件，酶解繼續(xù)，蛋白質(zhì)被更多的釋放出來(lái)。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到1 h之后，粗蛋白提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，然后在2.5 h之后趨于平衡狀態(tài)，其原因可能是餐廚垃圾中的蛋白質(zhì)已經(jīng)被完全釋放出來(lái)了，即使延長(zhǎng)酶解時(shí)間，粗蛋白提取率沒(méi)有明顯的增加，所以粗蛋白提取率也沒(méi)有明顯增幅。因此，確定最佳酶解時(shí)間為1 h。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)粗蛋白提取率的影響

3.2.4 酶加量對(duì)粗蛋白提取率的影響

由圖4可以看出，當(dāng)酶加量為30 mg時(shí)，粗蛋白提取率明顯高于其他酶加量下的粗蛋白提取率。說(shuō)明酶量過(guò)多或者過(guò)少，都會(huì)對(duì)粗蛋白提取率有一定的影響。酶添加量過(guò)大或者過(guò)小，都會(huì)影響酶解反應(yīng)速率，從而影響餐廚垃圾中蛋白質(zhì)的釋放，進(jìn)一步影響粗蛋白的提取率。由此可知，底物濃度充分的情況下，酶量的增加可使蛋白酶分子與底物碰撞的幾率增大，提升與底物結(jié)合的效率[14]。因此，酶解最佳酶投加量為30 mg。

圖4 酶加量對(duì)粗蛋白提取率的影響

3.3 酶解動(dòng)力學(xué)

從圖5可以看出，在保持酶濃度不變的條件下，隨著底物濃度的增加，蛋白質(zhì)濃度的增加速度呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的走勢(shì)。在底物濃度大于40 g/L時(shí)，反應(yīng)速度基本保持不變，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)量時(shí)，反應(yīng)速率基本不受底物濃度的影響。在此區(qū)域范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度相對(duì)于底物濃度是零級(jí)。圖6表明：木瓜蛋白酶酶解餐廚垃圾的動(dòng)力學(xué)遵循米氏方程的規(guī)律(表2)。

圖5 底物濃度與酶促反應(yīng)初速度的關(guān)系

圖6 餐廚垃圾酶解動(dòng)力學(xué)曲線

表2 酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

根據(jù)圖所得線性方程，可以得出木瓜蛋白酶水解下的米氏常數(shù)、最大反應(yīng)速率，將所得參數(shù)代入式(2)可得水解反應(yīng)的速率方程，結(jié)果如下式：

(2)

3.4 固態(tài)蛋白質(zhì)的提取

通過(guò)水酶法得到餐廚垃圾蛋白質(zhì)提取液。從圖7中可以看出，隨著pH值的增加，蛋白質(zhì)析出質(zhì)量先增加后減小，沉淀分離蛋白質(zhì)最多的點(diǎn)在pH值為6。說(shuō)明木瓜蛋白酶水解餐廚垃圾得到的蛋白質(zhì)提取液的最佳等電點(diǎn)為6，此處聚集了提取液中最多的蛋白質(zhì)群或者該等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)的含量是最多的。在最佳等電點(diǎn)pH值為6沉淀分離出來(lái)的蛋白質(zhì)質(zhì)量為23.49 mg/mL。說(shuō)明等電點(diǎn)法可以對(duì)餐廚垃圾酶解液中的粗蛋白進(jìn)行沉淀分離。

圖7 蛋白質(zhì)沉淀析出質(zhì)量

4 結(jié)論

(1)在餐廚垃圾酶解單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用最佳條件進(jìn)行了3 次重復(fù)試驗(yàn)，粗蛋白提取率為43.18%，說(shuō)明酶解法適用于餐廚垃圾中蛋白質(zhì)的提取研究。

(2)酶解動(dòng)力學(xué)的研究表明，木瓜蛋白酶酶解餐廚垃圾符合經(jīng)典的表征酶催化反應(yīng)特征的米氏方程所繪制的曲線，表明木瓜蛋白酶酶解餐廚垃圾的動(dòng)力學(xué)遵循米氏方程的規(guī)律。

(3)確定最佳等電點(diǎn)，對(duì)餐廚垃圾酶解液中的固體蛋白質(zhì)定向沉淀分離的研究，對(duì)后續(xù)沉淀分離出氨基酸提供基礎(chǔ)，從而拓寬了餐廚垃圾蛋白質(zhì)的利用范圍。