直腸癌組織中BRG1的表達(dá)及其與病理特征和預(yù)后的關(guān)系

趙 楠 魏 東 高春芳

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第989醫(yī)院結(jié)直腸乳腺疝外科 洛陽 471000)

直腸癌是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)和年輕化趨勢(shì)。直腸癌的病理進(jìn)程是一個(gè)涉及多因素、多階段、多基因的過程，遺傳因素、飲食因素與疾病的轉(zhuǎn)歸有關(guān)，原癌基因激活、抑癌基因失活也與疾病的發(fā)展有關(guān)。迄今為止，在直腸癌病理進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因仍未闡明。BRG1(Brahma-related gene1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制作用的基因，其編碼產(chǎn)物參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)SWI/SNF復(fù)合物的組成，SWI/SNF復(fù)合物能夠通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控、染色質(zhì)重構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄活性改變等途徑來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑癌活性[1～2]。已有多項(xiàng)研究報(bào)道，BRG1在結(jié)直腸癌、宮頸癌、胃癌組織中呈低表達(dá)趨勢(shì)[3～5]，但關(guān)于BRG1與直腸癌病理特征及預(yù)后的關(guān)系尚未明確。本研究具體分析了直腸癌組織中BRG1表達(dá)情況及其與病理特征、預(yù)后的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2015年8月～2019年6月期間我院手術(shù)切除的直腸癌標(biāo)本，均經(jīng)術(shù)后病理確診，共62例，TNM II期30例、III期32例，高分化28例、中低分化34例，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。所有患者術(shù)前均未接受放化療。即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于福建邁新生物公司，BRG1免疫組化抗體購(gòu)買于Santa Cruz公司，超純RNA提取試劑盒、SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑購(gòu)買于北京康為世紀(jì)公司。

1.2 方法

1.2.1BRG1表達(dá)情況的測(cè)定

取石蠟包埋的直腸癌組織，制作病理切片后采用即用型免疫組化超敏檢測(cè)試劑盒對(duì)BRG1進(jìn)行染色，在高倍鏡選取多個(gè)視野進(jìn)行觀察，細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為BRG1陽性。0%～25%細(xì)胞陽性為1分、26%～50%細(xì)胞陽性為2分、51%～75%細(xì)胞陽性為3分、76%～100%細(xì)胞陽性為4分；細(xì)胞無著色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。兩項(xiàng)乘積0～4分為低表達(dá)、6～16分為高表達(dá)。

1.2.2增殖基因表達(dá)的測(cè)定

取液氮冷凍的直腸癌組織，采用超純RNA提取試劑盒提取組織中的RNA后采用SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒將其合成為cDNA；取cDNA 1μL與UltraSYBR Mixture試劑10μL、引物混合物0.8μL、去離子水8.2μL混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：95℃ 20s、特異性退火溫度 15s、72℃ 25s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。基因引物序列、退火溫度如表1所示。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到循環(huán)閾值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算CyclinB1、CyclinE、p21、p27的mRNA表達(dá)量。

表1 基因引物序列及退火溫度

1.2.3隨訪

術(shù)后每3個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，隨訪方式包括電話隨訪、門診隨訪、住院復(fù)查等，隨訪內(nèi)容包括是否復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)時(shí)間、生存時(shí)間等，隨訪截止日期為2021年1月、隨訪時(shí)間19～65個(gè)月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同病理特征的直腸癌組織中BRG1的表達(dá)情況

TNM III期直腸癌組織中BRG1的高表達(dá)率低于TNM II期直腸癌組織，中低分化直腸癌組織中BRG1的高表達(dá)率低于高分化直腸癌組織，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸癌組織中BRG1的高表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸癌組織，見表2。

表2 不同病理特征的直腸癌組織中BRG1的表達(dá)情況

2.2 不同BRG1表達(dá)情況的直腸癌組織中增殖基因的表達(dá)量

BRG1高表達(dá)的直腸癌組織中CyclinB1、CyclinE的mRNA表達(dá)量明顯低于BRG1低表達(dá)的直腸癌組織，p21、p27的mRNA表達(dá)量明顯高于BRG1低表達(dá)的直腸癌組織，見表3。

表3 不同BRG1表達(dá)情況的直腸癌組織中增殖基因的比較

2.3 不同BRG1表達(dá)情況的直腸癌患者的預(yù)后情況

直腸癌組織中BRG1高表達(dá)的患者的無病生存時(shí)間、總生存時(shí)間均長(zhǎng)于BRG1低表達(dá)的患者，見表4；BRG1高表達(dá)的患者5年總體生存曲線高于BRG1低表達(dá)的患者，見圖1。

表4 不同BRG1表達(dá)情況的直腸癌患者的生存時(shí)間比較

圖1 不同BRG1表達(dá)情況的直腸癌患者的生存曲線

3 討論

直腸癌的發(fā)生及發(fā)展過程涉及多因素、多階段、多基因，探明在該過程中起到關(guān)鍵作用的基因有助于發(fā)現(xiàn)疾病治療的新靶點(diǎn)。SWI/SNF復(fù)合物所介導(dǎo)的染色質(zhì)重塑過程在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到重要作用，越來越多的研究表明惡性腫瘤進(jìn)程中伴有SWI/SNF復(fù)合物功能的減弱[6～7]。BRG1、BRM、SNF5、BAF155等是參與SWI/SNF復(fù)合物組成的分子，其中BRG1具有DNA依賴的具有ATP酶活性的類解旋酶亞基，在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等過程中均起到調(diào)控作用[8]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究證實(shí)，BRG1具有抑癌基因活性且在多種惡性腫瘤病灶內(nèi)呈低表達(dá)趨勢(shì)[3～5]。在國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，本研究分析了不同病理特征的直腸癌組織中BRG1表達(dá)量的差異，TNM III期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸癌組織中BRG1的高表達(dá)率明顯降低。這一結(jié)果提示BRG1的低表達(dá)不僅與直腸癌的發(fā)生有關(guān)，還參與直腸癌的病理進(jìn)程，與腫瘤分期的進(jìn)展、分化程度的降低、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移均存在密切關(guān)系。

BRG1主要通過阻礙細(xì)胞增殖來發(fā)揮抑癌基因活性，細(xì)胞內(nèi)多種增殖基因的表達(dá)過程受到BRG1的調(diào)控。CyclinB1和CyclinE是細(xì)胞周期的正性調(diào)控分子，通過與各自的激酶形成復(fù)合體來促進(jìn)細(xì)胞跨過細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，進(jìn)而加速細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞增殖[9]；p21和p27是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控分子，能夠抑制多種細(xì)胞周期蛋白激酶與Cyclin形成復(fù)合體，進(jìn)而使細(xì)胞周期發(fā)生停滯、細(xì)胞增殖受到抑制[10]。為了進(jìn)一步明確BRG1低表達(dá)在直腸癌病理進(jìn)程中的作用，本研究分析了不同BRG1表達(dá)量的直腸癌組織中上述增殖基因表達(dá)的差異，在BRG1高表達(dá)的直腸癌組織中，具有促增殖作用的CyclinB1、CyclinE呈低表達(dá)趨勢(shì)，而具有增殖抑制作用的p21、p27呈高表達(dá)趨勢(shì)。這一結(jié)果表明BRG1能夠減少促增殖基因的表達(dá)、增加增殖抑制基因的表達(dá)，直腸癌病灶內(nèi)低表達(dá)的BRG1能夠使促增殖基因的表達(dá)上調(diào)、增殖抑制基因的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)直腸癌病理進(jìn)程的發(fā)展。

直腸癌患者手術(shù)后的病情轉(zhuǎn)歸及預(yù)后直接受到腫瘤病理特征的影響。在腫瘤分期越高、分化程度越低的直腸癌病灶內(nèi)，癌細(xì)胞的增殖和侵襲活力越旺盛，更加容易發(fā)生遠(yuǎn)處微轉(zhuǎn)移[11]；而在已經(jīng)發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸癌病灶內(nèi)，癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了鄰近組織結(jié)構(gòu)的浸潤(rùn)，容易在手術(shù)后殘留微小病灶[12]。直腸癌手術(shù)后微小轉(zhuǎn)移病灶的殘留是遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的病理基礎(chǔ)。前一部分的結(jié)果已經(jīng)闡明病灶內(nèi)BRG1的低表達(dá)與直腸癌的病理進(jìn)程密切相關(guān)，為了進(jìn)一步闡明BRG1異常表達(dá)與直腸癌預(yù)后的關(guān)系，本研究在手術(shù)后對(duì)患者的生存期進(jìn)行了隨訪，直腸癌組織中BRG1高表達(dá)的患者的無病生存時(shí)間、總生存時(shí)間較長(zhǎng)且5年總體生存曲線明顯高于BRG1低表達(dá)的患者。這一結(jié)果提示直腸癌組織中BRG1的異常表達(dá)與直腸癌患者的預(yù)后直接相關(guān)，BRG1低表達(dá)患者的生存時(shí)間較短、預(yù)后較差。

綜上所述，直腸癌組織中BRG1的低表達(dá)與病理進(jìn)程發(fā)展、增殖活力加劇、生存時(shí)間縮短有關(guān)。