不同提取條件對吊干杏杏仁蛋白結構特性的影響

糟龍，陸健康，2*，張春蘭，2*，彭修春，曹甜甜，焦清波，齊薇燕

（1.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

吊干杏又稱“樹上干杏”，因其熟后不落，在樹上風干而得名，種植地區主要集中在新疆伊犁和阿克蘇地區[1]。吊干杏杏肉味美，營養豐富，含糖量高達27%[2]。研究發現甜杏仁營養成分包括蛋白質、脂肪、維生素等，其中蛋白質含量十分豐富，高達30.9%，并且含有17種氨基酸，其中8種氨基酸為人體所必需[3]，因此杏仁蛋白是一種優質植物蛋白，具有很高的食用價值和產品開發價值。

當前，國內外學者對杏仁的研究主要集中在以下幾個方面：杏仁蛋白的提取及其功能特性研究[4]；杏仁油脂提取及其生物活性研究[5]；不同提取方法（堿溶酸沉法、酶法、堿酶二步法、超聲輔助堿法、超聲輔助酶法以及水提和酶輔助水提法）對杏仁蛋白功能特性[6]和生物學特性[7]的影響。事實上，同一提取方法的不同分離條件也會影響蛋白質提取率、結構特性和功能特性[8]，不同分離條件對蛋白質提取率和功能特性的影響已有相關研究，而不同分離條件對蛋白質結構特性的影響研究鮮有報道。

目前對吊干杏的研究大多集中于吊干杏杏樹的栽培管理[9]、杏肉的采后貯藏[2]和保鮮[1]等，而對于吊干杏杏仁相關產品的深加工研究較少，因此，為推動杏仁產業的快速發展，有必要對吊干杏杏仁蛋白進行進一步研究。而對于蛋白質的提取如堿溶酸沉提取法，采用不同pH值進行堿溶處理或酸沉處理會造成蛋白質的空間結構發生改變。因此為減少提取條件對蛋白質空間結構產生的不良影響，本研究以新疆阿克蘇地區的吊干杏杏仁為試驗材料，采用堿溶（pH8、pH10、pH12）酸沉（pH4.5）方法分離提取杏仁蛋白，并研究不同的分離條件（堿溶pH值）對杏仁蛋白結構特性的影響，以期為吊干杏杏仁蛋白的深加工提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新疆阿克蘇地區吊干杏杏仁：市售；磷酸氫二鈉：洛陽市化學試劑廠；磷酸二氫鈉、溴酚藍：天津市風船化學試劑科技有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）：天津市博迪化工股份有限公司；丙烯酰胺、過硫酸銨：西格瑪奧德里奇貿有限公司；尿素、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disosium salt，EDTA-2Na）：天津致遠化學試劑有限公司；四甲基乙二胺、2-硝基苯甲酸（2-nitrobenzoic acid，DNTB）：上海海曲化工有限公司；彩虹180光譜蛋白marker（生物制劑）：北京索萊寶科技有限公司；甘氨酸、三（羥甲基）氨基甲烷：上海山浦化工有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

電子天平（LE203E）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高速冷凍離心機（GL-22LM）：湖南星科科學儀器有限公司；全自動定氮儀（KDY-9830）：北京市通潤源機電技術有限責任公司；冷凍干燥機（FD-1-50）：北京博醫康實驗儀器有限公司；酸度計（PHS-3C）：北京哈納科學儀器有限公司；超聲波清洗機（SB-5200DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HHS-S4）、電熱鼓風干燥箱（BGZ-246）：上海博迅實業有限公司；紫外分光光度計（UV2450/2550）：北京普析通用儀器有限公司；熒光光度計（Lumina）：上海君翼儀器設備有限公司；TG-DSC熱分析系統（STA449F3）：耐馳科學儀器商貿（上海）有限公司；電泳儀（DYY-6C）：北京六一儀器廠；納米粒度及ZETA電位分析儀（ZSE）：馬爾文帕納科上海思百吉儀器系統有限公司；比較測色儀（WSL-2）：上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 吊干杏杏仁蛋白的制備

將吊干杏杏仁粉碎后過40目篩，采用索氏提取法以石油醚為有機溶劑脫脂8 h，自然揮干12 h后粉碎過60目篩，得到吊干杏杏仁脫脂粉[10]。

參考Malomo等[11]的方法提取蛋白，探究不同堿溶pH值條件提取的蛋白對其結構性質的影響。脫脂粉∶水=1 ∶10（g/mL）混合，用 1 mol/L 的 NaOH 調至 pH8、pH10、pH12，25℃下磁力攪拌1 h后，4℃條件下離心（7 000 r/min，15 min），收集上清液后用上述條件對沉淀重復提取4次。合并上清液、過濾，用1 mol/L HCl調節pH值至4.5[12]。靜置20 min，在相同條件下離心后收集沉淀，用去離子水洗滌沉淀至中性，樣品冷凍干燥，即得杏仁蛋白粉。樣品1、2、3分別代表堿溶pH8、pH10、pH12，酸沉pH4.5條件下得到的杏仁蛋白粉。

1.2.2 吊干杏杏仁蛋白基本成分測定

1.2.2.1 水分測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中的直接干燥法測定水分[13]。

1.2.2.2 灰分測定

參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》中的干法灰化法測定灰分[14]。

1.2.2.3 蛋白質含量測定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱式定氮法測定蛋白質含量[15]。

1.2.3 表面疏水性的測定

參考CHELH等[16]的方法采用溴酚藍法測定表面疏水性，并作適當修改。將3種蛋白粉溶于pH7，0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中，使蛋白濃度達到5 mg/mL。取1 mL上述配制好的5 mg/mL蛋白樣液，加入200 μL1 mg/mL溴酚藍，并以無蛋白樣液的磷酸鹽溶液為對照。25℃下8 000 r/min離心15 min后，取上清液稀釋10倍，測定其595 nm波長下的吸光度A。每種蛋白測定3次后取平均值，溴酚藍結合量計算公式如下。

溴酚藍結合量/μg=200×（A對照-A樣品）/A對照

式中：A對照為無蛋白樣液的磷酸鹽溶液在595 nm波長下的吸光度；A樣品為蛋白樣液在595 nm波長下的吸光度。

1.2.4 巰基含量的測定

參考于小番等[17]方法測定杏仁蛋白巰基含量，并作適當修改。

1）游離巰基的測定：取2 mL制得的蛋白樣液（將吊干杏杏仁蛋白溶于pH7、0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液中，使蛋白濃度達到5 mg/mL），加入5 mLTris-甘氨酸緩沖溶液（0.086 mol/LTris、0.09 mol/L 甘氨酸、4 mmol/L EDTA-2Na混勻后調pH值為8）中，再加入0.1 mL 4 mg/mL DTNB的Ellman試劑（將DTNB溶于pH7、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中），在25℃下渦旋混勻后保溫反應15 min，用分光光度計測定412 nm處的吸光度A，以不加Ellman試劑的溶液作為空白對照，3組蛋白每組測定3次取平均值。

2）總巰基的測定：將上述游離巰基的測定中加入5 mLTris-甘氨酸緩沖溶液換為5 mLTris-甘氨酸-8 mol/L尿素-0.5%SDS緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液中再混入8 mol/L的尿素與0.5%SDS溶液中25℃超聲混勻），其他步驟同游離巰基的測定。

巰基含量計算公式如下。

式中：-SH為巰基含量，μmol/g；D為樣品稀釋系數；C為樣品的蛋白最終濃度，mg/mL。

1.2.5 羰基含量測定

參考吳大偉等[18]的方法測定蛋白羰基含量，并作適當修改。將3種蛋白分別溶于pH8、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中，使蛋白濃度為5 mg/mL。取1 mL配制好的5 mg/mL蛋白樣液，加入1 mL含有10 mmol/L的2，4-二硝基苯肼和2 mol/L的鹽酸溶液后渦旋混勻，30℃恒溫避光水浴1 h后，在每組離心管中加入0.4 mL 40%三氯乙酸，渦旋混勻并靜置15 min，10 000 r/min離心15 min后棄上清液，隨后加入1 mL無水乙醇∶乙酸乙酯=1∶1（體積比）重復洗滌蛋白質沉淀3次。將得到的蛋白質沉淀懸浮于6 mol/L的含有磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）pH7、0.2 mol/L 鹽酸胍溶液中，在37℃恒溫水浴20 min。空白為加1 mL不含2，4-二硝基苯肼的2 mol/L鹽酸，其他步驟同上。測定370 nm下的吸光度，每組樣品測定3次取平均值，以摩爾消光系數為22 000 L/（mol·cm），計算各組樣品中每mg蛋白質羰基衍生物的摩爾數。羰基含量計算公式如下。

式中：DF為樣品稀釋系數；ε為摩爾消光系數，22 000 L/（mol·cm）。

1.2.6 紫外吸收光譜掃描

參照Li等[19]的方法，3種蛋白分別溶于磷酸鹽緩沖液（pH 7、0.2 mol/L）中，使蛋白濃度為 1 mg/mL。用紫外分光光度計掃描蛋白的紫外吸收光譜，掃描速率為中速模式、波長為200 nm～360 nm、狹縫寬度為2 nm。取峰值變化最穩定的一組圖譜。

1.2.7 內源性熒光光譜掃描

參照JIA等[20]的方法，并適當修改。3種蛋白分別溶于的磷酸鹽緩沖液（pH8、0.2 mol/L）中，使蛋白濃度為0.1 mg/mL。用熒光光度計掃描蛋白的內源性熒光光譜圖，將掃描發射光譜調為300 nm～400 nm、掃描速度為1 200 nm/min、電壓為500 mV、激發波長和狹縫寬度均為5 nm。每組樣品分別在280 nm的激發波長下進行3次掃描，取峰值變化最穩定的一組圖譜。

1.2.8 熱性質研究

參照張清安等[21]的方法，稱取5 mg～8 mg蛋白粉置于氧化鋁坩堝中，壓力調節為0.03 MPa、保護氣流設為20 mL/min、吹掃氣流量設為60 mL/min，從30℃升溫至800℃，加熱速度選為10℃/min，進行熱重分析和差示掃描量熱分析。

1.2.9 Zeta電位測定

依據齊寶坤等[22]的方法，做適當修改。3種蛋白粉末比水更易溶于磷酸鹽（pH7、0.2 mol/L）緩沖液中形成穩定體系，使蛋白濃度為0.1 mg/mL。使用納米粒度及Zeta電位分析儀測定，選取Zeta電位模式，每組Zeta電位分析運行20次，平行3組，根據測量結果進行分析。

1.2.10 粒徑分布測定

使用Zeta電位分析中的備用待測蛋白溶液，同時將納米粒徑電位分析儀調至size模式，參數與Zeta電位模式相同，每組運行11次，平行3組，根據測量結果進行分析。

1.2.11 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考張君旗等[23]的方法，并作適當修改。采用13%的分離膠和5%的濃縮膠配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠。3種蛋白樣品溶于pH7、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中使其濃度達到0.25mg/mL，每種蛋白樣品與加樣緩沖液渦旋混勻后100℃加熱3 min～5 min，因為加樣緩沖液中含有還原劑β-巰基乙醇，所以在還原狀態下進行測定。加樣量為 20 μL，電泳緩沖液為 Tris-甘氨酸（0.125 mol/L Tris、1.25 mol/L甘氨酸、0.5%SDS），于25 mA下恒流進行。在濃縮膠中電壓40 V、40 min后樣液到達分離膠后升壓至100 V，3 h電泳結束。電泳完畢凝膠置于0.25%考馬斯亮藍染色液中染色6 h后進行反復脫色并用凝膠成像系統進行成像處理。

1.2.12 色度值測定

按色差儀儀器要求采用白板進行零校準，取具有代表性樣品，將樣品搖勻后放入樣品檢測池進行測定。通過儀器軟件讀取樣品的色澤指標L*為明度值；a*為紅度值；b*為黃度值；ΔE為總色差值；C為飽和度；H為色調角。

1.3 數據處理

試驗數據經Excel處理，采用Origin 2018軟件繪圖，采用統計軟件SPSS 26.0進行顯著性檢驗（P<0.05）分析。

2 結果與分析

2.1 吊干杏杏仁蛋白基本成分分析

吊干杏杏仁蛋白基本成分分析結果見表1。

表1 吊干杏杏仁蛋白基本成分分析Table 1 Analysis of basic components of dried apricot almond protein

由表1可知，3種蛋白的水分含量差異性顯著（P＜0.05），大小依次為樣品3＞樣品2＞樣品1。而3種蛋白的灰分含量差異性不顯著（P＞0.05）。3種杏仁蛋白粉的蛋白質含量差異顯著（P＜0.05），樣品 1、2、3 蛋白質含量分別為75.73%、78.27%、72.09%。pH10條件下得到的蛋白質含量顯著高于另外兩種條件得到的蛋白質含量，原因可能是pH8提取的蛋白未充分從原料中溶出，而在pH12條件下由于堿性過強，從而影響了蛋白質含量。

2.2 表面疏水性分析

表面疏水性分析結果見圖1。

圖1 吊干杏杏仁蛋白表面疏水性Fig.1 Surface hydrophobicity of hanging dried almond protein

表面疏水性是蛋白質的疏水區域暴露在表面的程度。一些疏水性氨基酸從蛋白質分子內部暴露到外部，會促進蛋白質解折疊從而增加表面疏水性[24]。由圖1可知，3種吊干杏杏仁蛋白中，與溴酚藍結合量大小依次為樣品3＞樣品2＞樣品1。溴酚藍吸附測定時，蛋白與溴酚藍結合量越多，表面疏水性就越高。結果表明在樣品pH12與pH10下制備的杏仁蛋白表面疏水性差異不顯著（P＞0.05），而pH12和pH10制備的杏仁蛋白其表面疏水性氨基酸含量均顯著高于pH8制備的杏仁蛋白（P＜0.05），這可能是較高pH值容易使蛋白質的結構發生變化或被破壞，造成內部的疏水性基團暴露在外從而增加表面疏水性。

2.3 巰基含量分析

巰基含量分析見圖2。

圖2 吊干杏杏仁蛋白總巰基和游離巰基含量Fig.2 Content of total and free sulfhydryl groups in hanging dried apricot almond protein

巰基是蛋白質中的一種重要功能性基團，與蛋白質的生物活性、氧化程度以及蛋白變形程度息息相關[25]。由圖2可知，3種吊干杏杏仁蛋白的總巰基和游離巰基含量大小依次為樣品2＞樣品1＞樣品3。分析結果表明3種蛋白的總巰基含量差異性顯著（P＜0.05），并且游離巰基含量差異也顯著（P＜0.05）。很可能是提取過程中堿溶pH值條件的不同而導致各蛋白的總巰基含量和游離巰基含量產生差異。本研究與劉利格[26]的研究趨勢相似，均為總巰基含量差異程度大于游離巰基含量差異程度，表明蛋白質均發生了不同程度地變性。在堿性環境下蛋白半胱氨酸中的巰基易被氧化形成二硫鍵，由圖2可知，樣品3的游離巰基/總巰基值最小，樣品2次之，樣品3與樣品2無顯著性差異（P＞0.05），表明樣品3和樣品2蛋白中大部分巰基形成二硫鍵，說明樣品3和樣品2相較于樣品1蛋白質結構更趨于緊湊[19]。

2.4 羰基含量分析

羰基含量分析見圖3。

圖3 吊干杏杏仁蛋白羰基含量Fig.3 Content of carbonyl group in amygdalin of hanging dried apricot

由圖3可知，樣品3羰基含量最高，為（4.91±0.11）nmol/mg；樣品 1羰基含量次之，為（4.09±0.16）nmol/mg；樣品 2羰基含量最低，為（3.28±0.09）nmol/mg。羰基生成過程復雜，是由活性氧攻擊氨基酸分子中自由氨基或亞氨基，經反應最終生成NH3和相應羰基衍生物[18]。因此蛋白羰基含量的高低可表明蛋白質被氧化的程度，3種蛋白的氧化程度差異顯著（P＜0.05）。氧化原因可能是蛋白質在堿性或強堿性環境中發生不同程度地變性，使原本在蛋白內部的自由氨基或亞氨基等基團分子暴露出來而被氧化。

2.5 紫外光譜分析

紫外光譜分析結果見圖4。

圖4 吊干杏杏仁蛋白紫外光譜的二階導數圖譜Fig.4 Second derivative spectra of hanging dried apricot almond protein

在常見的蛋白質氨基酸中，酪氨酸（tyrosine，Tyr）、色氨酸（tryptophan，Trp） 和苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）這3種芳香族氨基酸R基側鏈含有芳香環，因其各自生色基團不同（Tyr具有羥苯基，Trp具有吲哚基，Phe具有苯基）而具有不同的紫外吸收光譜[22]。

蛋白質紫外光譜的二階導數圖譜相較原始圖譜更能反映出對應波長的氨基酸含量。由圖4可知，在280 nm～300 nm之間存在3個吸收峰，其中295 nm附近的峰值是由Trp殘基決定，282 nm附近的峰值是由Tyr殘基決定[19]。在295 nm附近樣品2峰值最高，表明樣品2蛋白表面的Trp殘基含量最多。在282 nm樣品3的峰值最高說明樣品3蛋白表面的Tyr殘基含量最多，而樣品3在294 nm后Trp殘基吸收峰有所下降，原因可能是在pH12的強堿性環境下使蛋白質內部更多的親水性氨基酸Tyr殘基暴露在蛋白表面而掩蓋了蛋白質表面的疏水性氨基酸Trp，說明此時氨基酸環境向更加親水的方向轉移[27]。而樣品2和樣品1可能是提取過程中的堿性環境較弱，使得蛋白質的結構變化小，導致蛋白質內部的Tyr殘基暴露在蛋白質表面的含量較低，由此推斷蛋白質分子的構象。

2.6 熒光光譜分析

熒光光譜分析結果見圖5。

在常見的蛋白質氨基酸中，具有芳香結構的氨基酸如Tyr、Trp和Phe為熒光物質分子。在280 nm條件下Tyr和Trp都產生熒光，但主要由Trp殘基產生熒光。由圖5可知，在280 nm的激發波長下3種蛋白最大吸收波長在325.8nm～330.8 nm之間無明顯差異。當λmax＜330 nm時，Trp殘基位于蛋白質的內部非極性區，由此說明3種蛋白的Trp殘基所處微環境基本相似都為內部非極性區[28]。但3種蛋白的最大熒光強度大小依次為樣品 2（1 520.6 cnt）＞樣品 1（1 458.3 cnt）＞樣品3（1 225.2 cnt）。所以3種蛋白Trp殘基暴露數量由大到小依次為樣品2＞樣品1＞樣品3。在280 nm激發波長下，樣品1和樣品2蛋白的最大熒光強度較為接近。蛋白的最大熒光強度間差異反映了蛋白質種類及其含量的不同，并且在折疊構象上也存在差異[20]。以上結果表明樣品1與樣品2所含蛋白種類及數量接近，構象相似。

圖5 吊干杏杏仁蛋白在280 nm激發波長下的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectrum of hanging dried almond protein at 280 nm excitation wavelength

2.7 熱性質分析

2.7.1 熱重分析

杏仁蛋白的熱重分析曲線見圖6。

圖6 吊干杏杏仁蛋白的熱重分析曲線Fig.6 Thermogravimetric analysis curve of dried apricot almond protein

由圖6可知，吊干杏杏仁蛋白的熱重曲線對溫度的一階導數（first derivative of a thermogravimetric curve withrespecttotemperature，DTG）分析曲線主要分3個階段。第一階段為30℃～200℃，主要是水分的蒸發而使其質量發生變化。第二階段和第三階段分別為201℃～501℃和501℃～800℃[25]。由圖6 A可知，在第一階段樣品1分解發生明顯變化，而其質量損失大部分在第二階段，主要是蛋白質降解和碳水化合物降解所致。在326.81℃時失重率最高達30.69%，而在469.25℃失重率最低達55.08%。第三階段的樣品質量減輕是由于第二階段的固體殘留物緩慢分解，灼燒至只殘留部分無機鹽物質時到達終點。在620.94℃時最高失重率達75.46%。最終在771.01℃殘留質量僅為4.35%。由圖6 B可知，樣品2的最大失重率在326.87℃和621.22℃，殘留質量為3.96%。如圖6 C樣品3的最大失重率在316.65℃和630.94℃，殘留質量為6.71%。

3種蛋白在同等參數條件下，樣品3在第二階段最大失重率最低，說明樣品3此階段熱穩定性最好，依次為樣品2、樣品1。樣品2殘留質量最低，說明樣品2無機鹽含量最低。樣品1與樣品2的殘留質量和第二階段失重率接近，說明二者蛋白純度接近，蛋白中蛋白種類較相似。而樣品3殘留質量最大，可能含有較多熔點高的無機鹽分子。

2.7.2 差示掃描量熱分析

差示掃描量熱分析（differential scanning calorimetry analysis，DSC）通過蛋白質的熱變性溫度來評價蛋白質的熱穩定性，通過蛋白質的熱變性焓變值來評價蛋白質分子的空間結構有序性[24]。差示掃描量熱分析曲線見圖7。

圖7 吊干杏杏仁杏仁蛋白DSC曲線Fig.7 DSC curve of amygdalin in hanging dried apricot almond

由圖7 A可知，樣品1的熱變性溫度為89.98℃，熱變性溫度峰值對應的峰面積值代表焓變值，為11.76J/g[24]。結合吊干杏杏仁蛋白的熱重分析曲線，在89.98℃處于蛋白分解的第一階段，大部分水分子蒸發，吸熱開始逐漸分解。由圖7 B與圖7 C可知，樣品2的熱變性溫度為90.21℃，焓變值為13.30 J/g；樣品3的熱變性溫度為81.084℃，焓變值為10.28 J/g。熱穩定性大小依次為樣品2＞樣品1＞樣品3，3種蛋白的熱變性溫度差異較小，表明熱穩定性3者較為接近。熱變性溫度峰值下對應的焓變值大小依次為樣品2＞樣品1＞樣品3，與熱變性溫度大小順序一致，表明在蛋白分解的第一階段蛋白分子空間結構的有序性與熱穩定性呈正相關。

2.8 Zeta電位分析

蛋白質表面氨基酸所帶電荷的多少和電荷的正負性影響著蛋白質表面電位，從而影響了蛋白質溶液的Zeta電位值[29]。Zeta電位的大小能夠很好的反映蛋白溶液分散體系的穩定性[22]。杏仁蛋白溶液的Zeta電位分析結果見圖8。

圖8 吊干杏杏仁蛋白的Zeta電位Fig.8 Zeta potential of hanging dried almond protein

由圖8可知，樣品1、樣品2和樣品3的電位值電勢依次為-6.909 51、-13.543 28、-13.543 28 mV。3種蛋白Zeta電位值均為負值，表明蛋白表面帶負電荷的氨基酸多于帶正電荷的氨基酸；另一方面磷酸鹽緩沖液pH值為7高于杏仁蛋白的等電點導致具有兩性性質的蛋白分子吸附陰離子[30]。而蛋白溶液Zeta電位絕對值越大則分子表面同性電荷越多，蛋白溶液通過分子間靜電斥力使溶液體系越穩定。3種蛋白其中樣品3與樣品2這兩種蛋白的Zeta電位值相等，但樣品3的電位分布值高于樣品2，所以3種蛋白溶液體系的穩定性大小依次為樣品3＞樣品2＞樣品1。造成這一現象原因可能是由于蛋白堿溶提取時pH值的不同使得到的蛋白中的蛋白種類和數量有較大差異，從而使暴露在蛋白質表面的親水性氨基酸種類及數量產生差異。

2.9 粒徑分布分析

3種蛋白溶液的粒徑分布見圖9。

由圖9可知，3種蛋白的溶液粒徑集中分布在200 nm～500 nm之間，樣品1的粒徑分布百分比最高，平均粒徑尺寸為411.77 nm；樣品2的粒徑分布百分比最低，平均粒徑尺寸為286.15 nm；樣品3的粒徑分布百分比率低于樣品1，平均粒徑尺寸為268.86 nm。此外樣品2與樣品3在5 nm～15 nm處也略有分布。

圖9 吊干杏杏仁蛋白的粒徑分布Fig.9 Particle size distribution of amygdalin in hanging dried apricot

蛋白質顆粒沉降速度與蛋白質之間的疏松程度、溶液的密度等有關，本試驗3種蛋白密度一致，所以沉降速度相同，這為判斷3種蛋白溶液體系的穩定性減少誤差。DAY[31]研究發現乳液的粒徑大小對乳液穩定性具有重要影響。此外也有研究發現蛋白質顆粒的粒徑越小，系統的穩定性越高[32]。所以3種蛋白溶液體系的穩定性大小依次為樣品3＞樣品2＞樣品1，與上述Zeta電位分析結果一致。

2.1 0 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可分開蛋白質，因此蛋白質的亞基遷移率主要取決于亞基分子量的大小[23]。3種蛋白亞基分子量分布見圖10。

圖10 吊干杏杏仁蛋白SDS-PAGE分析圖譜Fig.10 SDS-PAGE analysis of hanging dried apricot almond protein

由圖10可知，3種蛋白的亞基分子量大小主要集中在20 kDa和22 kDa兩條條帶。除此之外還包含顏色較淺的30、35、63 kDa條帶。在20 kDa和22 kDa兩條條帶上，樣品2較樣品1的條帶豐度更高，而樣品3豐度最高。在30 kDa條帶上濃度大小依次為樣品3＞樣品2＞樣品1。在35 kDa條帶上濃度大小依次為樣品3＞樣品2＞樣品1。在63 kDa條帶上3種蛋白條帶豐度相近。綜上所述樣品3較于樣品2和樣品1在分子量20 kDa和22 kDa的亞基含量更多，在其他分子量上分布也最廣。由此可以判斷在pH值較高的堿性環境中提取蛋白時可能導致蛋白不同程度的變性，從而破壞蛋白質中的二硫鍵或肽鍵等作用力，導致其亞基分布較廣，分子量更多地集中在20 kDa和22 kDa低分子量的多肽上。

2.1 1 色度分析

不同pH值提取的杏仁蛋白色度值的差異見表2。

表2 吊干杏杏仁蛋白色度值Table 2 Color value of hanging dried almond protein

由表2可知，3種蛋白L*值較高，表明蛋白較白、亮。但3種蛋白L*值差異不顯著（P＞0.05），可能是蛋白分離物中都含有較多的淀粉等白色物質。3種蛋白a*值均為負數，表明3種蛋白顏色偏綠差異不顯著（P＞0.05）；3種蛋白b*值均為正數，表明3種蛋白顏色偏黃。樣品2和樣品3較樣品1顯著（P＜0.05）；可能是提取時堿溶pH值較高蛋白更容易被氧化而造成的顏色偏黃。樣品1蛋白的總色差ΔE顯著高于其他兩種樣品蛋白（P＜0.05）。樣品2的色調角顯著高于其他兩種蛋白（P＜0.05）。樣品2與樣品3色飽和度差異不顯著（P＞0.05），可能是2種蛋白分離物中彩色物質的種類和數量接近造成的。綜上所述，3種蛋白整體上為白色，在白色的基礎上偏黃偏綠，且樣品2和樣品3在偏黃色上均顯著高于樣品1。

3 結論

在3種蛋白中樣品3的表面疏水性、被氧化的程度、表面Tyr殘基含量及蛋白溶液穩定性均最大。樣品2表面Trp殘基含量最多。熱性質分析表明樣品1與樣品2在空間構象和蛋白種類及數量上較為相似，樣品1和樣品2都與樣品3差異顯著；3種蛋白熱穩定性依次為樣品2>樣品1>樣品3，且3種蛋白熱穩定性接近；同時說明吊干杏杏仁蛋白變性溫度較低，在加工此類產品時應合理控制溫度以防止蛋白變性。凝膠電泳表示3種蛋白亞基含量主要集中在20 kDa和22 kDa，且樣品3的豐度最高亞基分布最廣。3種蛋白顏色在白色基礎上偏黃偏綠，且樣品2和樣品3在偏黃色上均顯著高于樣品1。綜上所述，不同pH值提取條件對于吊干杏杏仁蛋白的結構特性具有顯著影響，這為吊干杏杏仁蛋白的進一步研究和應用提供了理論依據。