丙泊酚調控HIF-1α表達靶向SIRT1信號通路對胰腺癌細胞增殖凋亡的影響

梁銀銀 周顯飛

[摘要] 目的 探討丙泊酚對胰腺癌細胞增殖凋亡的影響，進一步分析丙泊酚對胰腺癌細胞中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和沉默信號調節因子1（SIRT1）信號通路的影響。 方法 分別采用5 μg/ml和10 μg/ml的丙泊酚處理胰腺癌Panc-1細胞48 h，設置control組、低劑量組和高劑量組。采用CCK8檢測各組細胞的增殖能力，采用Hoechst 33258對各組細胞的凋亡指標進行檢測，應用ELISA法測定各組細胞的炎癥因子水平，應用qPCR法對SIRT1信號通路mRNA的表達水平進行評判。 結果 與control組相比，低劑量組、高劑量組的增殖能力顯著降低（P<0.01），凋亡水平顯著升高（P<0.01）;炎癥因子IL-6（P<0.01）和IL-1β（P<0.01）水平顯著升高，凋亡相關蛋白Fas和FasL的表達顯著升高（P<0.01），Bcl-2/Bax顯著降低（P<0.01），HIF-1α mRNA的表達水平顯著升高（P<0.01），SIRT1 mRNA的表達水平顯著降低（P<0.01），HIF-1α蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.01），SIRT1蛋白的表達水平顯著降低（P<0.01）。 結論 丙泊酚調控HIF-1α表達靶向SIRT1信號通路會促進胰腺癌細胞增殖，加速凋亡。

[關鍵詞] 胰腺癌;丙泊酚;SIRT1信號通路;增殖;凋亡

[中圖分類號] R735.9? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）04-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of propofol on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells， and to further analyze the effect of propofol on hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） and silencing signal regulator 1 （SIRT1） signaling pathway in pancreatic cancer cells. Methods Pancreatic cancer Panc-1 cells were treated with 5 μg/ml and 10 μg/ml propofol for 48 h， respectively. The control group， low-dose group， and high-dose group were set. CCK8 was used to detect the proliferation ability of cells in each group. Hoechst 33258 was used to detect the details of apoptotic indicators of cells in each group. ELISA was used to determine the levels of inflammatory factors in each group， and qPCR was used to evaluate the expression levels of SIRT1 signaling pathway mRNA. Results Compared with the control group， the proliferation ability of the low-dose group and the high-dose group was significantly reduced （P<0.01）; the apoptosis level was significantly increased （P<0.01）; the inflammatory factor IL-6 （P<0.01） and IL-1β （P<0.01） increased significantly; the expression of apoptosis-related proteins Fas and FasL was significantly increased （P<0.01）; Bcl-2/Bax was significantly decreased （P<0.01）; the expression level of HIF-1α mRNA was significantly increased （P<0.01）; the expression level of SIRT1 mRNA was significantly decreased （P<0.01）; the expression levels of HIF-1α protein were significantly increased （P<0.01）; and the expression level of SIRT1 protein was significantly decreased （P<0.01）. Conclusion Propofol regulating HIF-1α expression targeting the SIRT1 signaling pathway can promote the proliferation of pancreatic cancer cells and accelerate apoptosis.

[Key words] Pancreatic cancer; Propofol; SIRT1 signaling pathway; Proliferation; Apoptosis

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是胰腺導管上皮細胞DNA的異常突變導致的惡性腫瘤，是臨床上最常見的惡性腫瘤之一[1]。流行病學調查研究發現，胰腺癌的發病率呈逐年增長的趨勢，具有惡性化程度高、死亡率高的特點，早期的腫瘤細胞極易擴散至淋巴結及肺、肝臟等器官，5年生存率不超過10%[2]。大多數胰腺癌患者往往因腫瘤擴散和血管浸潤而喪失手術條件，只能采用放療、化療等手段進行輔助治療，但效果較差，目前手術切除仍是胰腺癌患者最有效的治療手段[3]。臨床數據表明，圍術期麻醉對于腫瘤細胞的炎癥反應、免疫應激反應產生較大影響，會影響腫瘤細胞的增殖和凋亡[4-5]。丙泊酚是臨床上常用的全身麻醉藥物之一，常用于多種途徑的鎮靜和麻醉過程，具有起效快、可控性好和代謝快的優點[6]。近年來，研究者發現，丙泊酚與多種腫瘤的生物學效應及預后密切相關，其通過影響腫瘤細胞內自由基及炎癥損傷過程而調控腫瘤細胞的增殖[7]。Chen等[8]研究發現，氟烷可影響乳腺癌細胞的缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的表達，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，促進術后腫瘤細胞出現自發性肺轉移。沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是組蛋白乙酰化酶，是腫瘤治療和診斷的靶點，激活SIRT1信號通路可抑制細胞的凋亡、炎癥和氧化反應[9]。目前有關丙泊酚對SIRT1信號通路及胰腺癌細胞的調控作用研究尚少，本課題擬通過體外實驗研究丙泊酚對SIRT1信號通路、胰腺癌細胞的常規調控水平，為胰腺癌患者手術治療的麻醉劑的選擇提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

胰腺癌Panc-1細胞購自中國科學院上海細胞庫;DMEM培養基（Gibco公司）;胰蛋白酶（Sigma公司）;胎牛血清（Gibco公司）;丙泊酚（Sigma公司）;CCK8試劑盒（Sigma公司）;Hoechst細胞33258試劑盒（碧云天生物科技有限公司）;白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（博士德生物科技有限公司）;白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（博士德生物科技有限公司）;BCA蛋白定量試劑盒（美國Invitrogen公司）;PVDF膜（Millipore公司）;Fas、FasL、Bax、Bcl-2、HIF-1α、SIRT1和GAPDH單克隆抗體（Abcam公司）;二抗（上海銀海圣生物科技有限公司）;ELC發光液（Thermo Fisher Scientifice公司）;RNA提取試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）;逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）;應用Life Technologies 公司生產的Taq Man?Micro RNA Reverse Transcription Kit試劑盒;BIO-RAD公司生產的酶標儀;COSTAR公司生產的96孔板;COSTAR公司生產的6孔板;賽默飛科技有限公司生產的細胞培養箱;德國Sartorious公司生產的電子天平，其他相關儀器和試劑均已在相關部分說明。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理? 復蘇細胞后接種于培養瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中進行培養，細胞長至80%即可傳代。采用胰蛋白酶消化細胞，設置5×104個/孔的細胞密度，將其接種于96孔板中，并向其加入適量的10%胎牛血清放入DMEM培養基中培養。設置control組、低劑量組和高劑量組，低劑量組細胞加入5 μg/ml的丙泊酚處理細胞，高劑量組細胞加入10 μg/ml的丙泊酚處理細胞，Control組加入等量的血清進行空白處理，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中繼續培養，處理48 h后檢測各組細胞的生物學特性。

1.2.2 CCK8檢測細胞的增殖能力? Control組、低劑量組和高劑量組細胞經不同濃度的丙泊酚處理48 h，采用CCK8檢測各組細胞的增殖能力，每孔加入10 μl的CCK8溶液，繼續置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養4 h，酶標儀參數：450 nm，檢測各組細胞的OD值，確定細胞的增殖能力。

1.2.3 Hoechst 33258檢測細胞的凋亡水平? 采用胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度為1×106個/孔，并與6孔板連接，向其加入適量的含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱中，Control組、低劑量組和高劑量組細胞經不同濃度的丙泊酚處理48 h，采用Hoechst 33258檢測各組細胞的凋亡水平，棄去上清液，加入新鮮配置的4%多聚甲醛固定30 min，用PBS清洗3次，每孔加入50 μl的Hoechest 33258染色劑，置于室溫下避光孵育10 min。用熒光顯微鏡拍照，記錄各組細胞的狀態，計算各組細胞的凋亡水平。正常的細胞為暗藍色，細胞核中出現高亮的藍色則表明細胞出現凋亡，計為凋亡細胞。

1.2.4 ELISA法檢測細胞中炎癥因子的水平? 采用胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度為1×106個/孔接種于6孔板中，加入適量的含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，Control組、低劑量組和高劑量組細胞經不同濃度的丙泊酚處理48 h，采用ELISA法對患者各組細胞中IL-6、炎癥因子、IL-1β指標水平實施檢測，并根據試劑盒說明書進行操作，酶標儀參數：450 nm，檢測細胞OD值，測定炎癥因子IL-1β、IL-6水平。

1.2.5 Western blot檢測蛋白的表達水平? 采用胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度為1×106個/孔接種于6孔板中，向其加入適量的含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱中，Control組、低劑量組和高劑量組細胞經不同濃度的丙泊酚處理48 h，棄去上清液，加入適量的RIPA裂解液裂解細胞，離心機參數：4℃、12 000 rpm，離心10 min后取上層清液，應用BCA蛋白定量試劑盒對各組細胞的蛋白濃度進行檢測，制備等濃度的上樣緩沖體系，95℃水浴鍋煮沸滅活，采用12%的SDS聚丙烯酰胺濃縮膠和分離膠進行電泳，當其進行轉膜后可實施蛋白轉移，將其置于PVDF膜上，并新鮮配置5%脫脂奶粉，將其封閉PVDF膜中2 h，根據目的條帶的分子量大小切下目的條帶，分別于4℃條件下孵育Fas、FasL、Bax、Bcl-2、HIF-1α、SIRT1和GAPDH（抗體均采用1∶1000稀釋）過夜，用TBST洗滌蛋白條帶3次，于室溫條件下孵育辣根過氧化物酶共軛的二抗（采用1∶5000稀釋）1 h，用TBST洗滌蛋白條帶3次，暗室內加入ECL發光液（A液與B液按1∶1混勻）后進行顯影和定影，再將條帶掃描后利用Image J軟件進行灰度值分析。

1.2.6 qPCR檢測相關mRNA的表達水平? 采用胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度為1×106個/孔，并與6孔板連接，向其加入適量的含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱中，Control組、低劑量組和高劑量組細胞經不同濃度的丙泊酚處理48 h，棄去上清液，加入適量的Trizol，采用RNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，測定總RNA濃度和純度。按照逆轉錄試劑盒的操作，配置25 μl的反應體系，逆轉錄后獲得cDNA。配置qPCR反應體系，反應條件為：94℃變性5 min，95℃ 30 s，63℃ 50 s，72℃ 60 s，共35個循環，以GAPDH為內參，測定各組細胞中HIF-1α和SIRT1 mRNA的相對表達水平。引物由英濰捷基生物科技有限公司合成，序列見表1。

1.3 統計學方法

采用SPSS 24.0統計學軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步采用Bonferroni校正的t檢驗進行兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。P<0.05為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1丙泊酚對胰腺癌細胞增殖的影響

采用CCK8檢測丙泊酚對胰腺癌細胞增殖能力的影響，結果顯示低劑量組和高劑量組細胞的增殖能力明顯低于control組，高劑量組細胞的增殖能力明顯低于低劑量組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖1。

2.2 丙泊酚對胰腺癌細胞凋亡的影響

采用Hoechst 33258檢測丙泊酚對胰腺癌細胞凋亡水平的影響，結果顯示高劑量組、低劑量組細胞的凋亡水平明顯高于control組，高劑量組細胞的凋亡水平明顯高于低劑量組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖2。

2.3丙泊酚對胰腺癌細胞炎癥因子水平的影響

采用ELISA試劑盒檢測丙泊酚對胰腺癌細胞炎癥因子水平的影響，結果顯示低劑量組、高劑量組細胞IL-6與IL-1β水平均明顯高于control組，高劑量組細胞IL-6與IL-1β水平均明顯高于低劑量組，差異有統計學意義（P<0.01）。見表2。

2.4 丙泊酚對胰腺癌細胞凋亡蛋白表達的影響

采用Western blot檢測丙泊酚對胰腺癌細胞中凋亡相關蛋白表達的影響，結果顯示低劑量組、高劑量組細胞Fas與FasL的表達水平均明顯高于control組，Bcl-2/Bax明顯低于control組，差異有統計學意義（P<0.01）;高劑量組細胞Fas與FasL的表達水平均明顯高于低劑量組，Bcl-2/Bax明顯低于低劑量組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖3。

2.5 丙泊酚對胰腺癌細胞SIRT1信號通路的影響

分別采用qPCR和Western blot檢測丙泊酚對胰腺癌細胞SIRT1信號通路的影響，結果顯示兩種檢測方法結果一致。低劑量組、高劑量組細胞HIF-1α mRNA與蛋白的表達水平均明顯高于control組，SIRT1 mRNA與蛋白的表達水平均明顯低于control組，差異有統計學意義（P<0.01）;高劑量組細胞HIF-1α mRNA與蛋白的表達水平均明顯高于低劑量組，SIRT1 mRNA和蛋白的表達水平均顯著低于低劑量組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖4～5。

3討論

胰腺癌是惡性化程度很高的腫瘤之一，具有侵襲性強、進展快的特點，對多種化療藥物不敏感，故手術切除是目前早期胰腺癌患者最常用的治療手段[10]。胰腺癌圍術期會受到多種因素影響，產生免疫、內分泌系統功能異常，導致腫瘤擴散，對患者的預后產生影響。研究表明，不同麻醉藥物會對腫瘤細胞的惡性潛在性能產生影響。丙泊酚屬于臨床常見的靜脈麻醉藥。相關研究發現，丙泊酚能夠實現胰腺癌細胞的惡性潛能抑制。程序性死亡因子、程序性死亡配體屬于一對免疫共刺激分子，二者均參與腫瘤的發生及發展。

臨床研究表明，胰腺癌組織的高表達與淋巴結轉移情況存在一定聯系，影響患者的預后。相關實驗證明，胰腺癌細胞的高表達能夠有效實現細胞增殖，PD-Ll低表達能夠有效抑制胰腺癌種植瘤的生長。

Carmicheal等[10]研究發現，麻醉劑可參與腫瘤細胞的病理和生理過程，影響血管生成，介導細胞的增殖和凋亡過程。本研究采用體外實驗研究丙泊酚對胰腺癌細胞Panc-1增殖和凋亡的影響，結果發現，5 μg/ml和10 μg/ml的丙泊酚處理胰腺癌Panc-1細胞48 h可導致細胞的增殖能力顯著降低，凋亡水平顯著增加，且具有劑量依賴性，高濃度的丙泊酚更能有效抑制胰腺癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。本研究進一步發現，丙泊酚可顯著增加胰腺癌細胞中凋亡蛋白Fas與FasL的表達，降低Bcl-2/Bax的表達。FasL為Fas的配體，均屬于腫瘤壞死因子家族的細胞表面受體，細胞內Fas與FasL的表達水平增加，其相互作用可導致細胞凋亡;Bcl-2是抗凋亡家族成員，可通過抑制細胞內線粒體凋亡過程而降低細胞的凋亡，臨床上常采用Bcl-2/Bax評價腫瘤的凋亡水平[11-12]。激活腫瘤細胞凋亡途徑可誘導細胞釋放大量的炎癥因子，嚴重的炎癥反應可進一步激活細胞自噬過程，進一步損傷細胞[13]。本研究結果顯示，丙泊酚可顯著增加胰腺癌細胞內炎癥因子IL-6與IL-1β的水平。

低氧誘導處理可導致缺氧誘導因子-1廣泛存在于人體和哺乳動物體內，是參與細胞內氧代謝調控的重要細胞調節因子，由120 kD的α亞基和91～94 kD的β亞基組成的異源二聚體[14-20]。本研究結果表明，丙泊酚可抑制胰腺癌細胞SIRT信號通路，顯著降低胰腺癌細胞中SIRT1 mRNA和蛋白的表達。

綜上所述，丙泊酚通過激活胰腺癌細胞中HIF-1α的表達，進而靶向抑制SIRT1信號通路，增加細胞內炎癥因子釋放，增強細胞內凋亡蛋白的表達，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖，該研究結果為臨床上胰腺癌患者手術過程中選擇合適的麻醉劑提供理論依據。

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（收稿日期：2021-01-20）