春尺蠖嗅覺受體基因的鑒定與差異分析

王 霞，查 干，娜仁格日樂，郝則明，王 建，陳 龍

（1.河套學(xué)院，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2.內(nèi)蒙古巴彥淖爾市草原工作站，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；3.內(nèi)蒙古巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；4.內(nèi)蒙古烏拉特前旗草原工作站，內(nèi)蒙古烏拉特前旗 014407）

昆蟲在長期的進(jìn)化過程中，聽覺和視覺系統(tǒng)逐漸退化，其捕食、交流和求偶等生命活動主要依賴嗅覺系統(tǒng)，因此，昆蟲的嗅覺系統(tǒng)尤為發(fā)達(dá)，以便適應(yīng)多變的外界環(huán)境［1］。昆蟲對氣味分子識別是一個復(fù)雜的過程，同時需要多個蛋白參與其中，首先與特異性的氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）結(jié)合，經(jīng)過昆蟲細(xì)胞間的淋巴液，進(jìn)而到達(dá)嗅覺感受器的神經(jīng)元，被嗅覺受體（olfactory receptors，ORs）識別后，同時激活嗅覺受體，使其產(chǎn)生嗅覺神經(jīng)沖動，從而做出一系列生理反應(yīng)行為［2-5］。因此，嗅覺受體在氣味的識別過程中發(fā)揮極其重要的作用。

近年來，高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，極大地促進(jìn)了昆蟲，尤其是無參昆蟲的基因組、轉(zhuǎn)錄組等相關(guān)研究的發(fā)展。目前，轉(zhuǎn)錄組測序在非模式昆蟲的基因鑒定、功能研究和遺傳多樣性分析等方面有廣泛應(yīng)用。國內(nèi)外許多學(xué)者通過轉(zhuǎn)錄組測序分析鑒定了大量昆蟲受體基因［6-11］。這些受體分為傳統(tǒng)型嗅覺受體（conventional，ORs）和嗅覺受體共受體（olfactory receptor co-receptor，Orco）［12-13］。在不同昆蟲中傳統(tǒng)受體基因變異較大，導(dǎo)致序列一致性較低，而嗅覺受體共受體則具有較高的保守性。Orco的作用不是獨立的，而是與ORs形成異質(zhì)二聚復(fù)合體，從而共同發(fā)揮作用。Orco的作用在于促進(jìn)ORs在神經(jīng)元樹突上的定位，同時維持其穩(wěn)定性，進(jìn)而使ORs對氣味分子的反應(yīng)效率提高［14-17］。

春尺蠖（Apocheima cinerarius）作為內(nèi)蒙古草原上近年來爆發(fā)成災(zāi)的新害蟲，其取食寄主范圍廣，嚴(yán)重危害當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境，給農(nóng)牧民生產(chǎn)生活和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成了嚴(yán)重?fù)p失。春尺蠖的繁殖、求偶、避害等一系列生命活動均離不開嗅覺，為挖掘春尺蠖嗅覺受體基因，明確雌雄成蟲差異表達(dá)受體基因在氣味分子識別中的作用，本研究基于實驗室前期已完成的春尺蠖成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法鑒定得到氣味受體蛋白，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，同時分析春尺蠖ORs在雌雄成蟲中的差異表達(dá)情況，旨在為春尺蠖對嗅覺受體基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，同時為該蟲生物防治提供新思路。

1 研究內(nèi)容與方法

1.1 春尺蠖嗅覺受體ORs基因的鑒定

根據(jù)已完成的春尺蠖成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提供Unigenes的注釋轉(zhuǎn)錄本信息，以嗅覺受體（odorant receptor，OR）作為關(guān)鍵詞對數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄本信息進(jìn)行篩選，找到含有關(guān)鍵詞所對應(yīng)的所有Unigenes，將它們作為候選基因。為進(jìn)一步驗證候選基因，利用NCBI網(wǎng)站中的BlastP在線工具對NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，參數(shù)為e值<10-5。利用在線預(yù)測工具SignalIP5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對上述鑒定到的候選嗅覺受體蛋白ORs蛋白的信號肽進(jìn)行預(yù)測。使用軟件DNAMAN V6.0（Lynnon Biosoft，加拿大）預(yù)測春尺蠖ORs的分子量和等電點，同時進(jìn)行序列對比分析。

1.2 春尺蠖嗅覺受體蛋白ORs進(jìn)化樹構(gòu)建

為明確春尺蠖嗅覺受體蛋白與其他昆蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法（Neighbour-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其參數(shù)選擇模型采用p距離（P-distance），重復(fù)運行1 000次。

1.3 春尺蠖ORs基因在雌雄成蟲差異表達(dá)

轉(zhuǎn)錄組（未發(fā)表）測序昆蟲來源于內(nèi)蒙古烏拉特前旗人工檸條草場（E：108°45′23.63″；N：40°46′4.19″），2019年冬季將春尺蠖越冬蛹置于恒溫（22±1）℃、光周期L∶D=18 h∶6 h、相對濕度55%~59%條件下的人工氣候箱中培養(yǎng)，待春尺蠖羽化后，分別選取羽化第3 d大小相同、活力充沛的雌、雄蛾成蟲各5頭，用液氮速凍后置于-80℃冰箱中備用。

本研究旨在初步比較春尺蠖雌雄成蟲的基因表達(dá)差異，特別是二者間嗅覺相關(guān)基因的差異表達(dá)情況。由于本試驗轉(zhuǎn)錄組無生物學(xué)重復(fù)（后續(xù)將利用qPCR技術(shù)對差異基因進(jìn)行進(jìn)一步驗證分析），故根據(jù)轉(zhuǎn)錄組雌、雄成蟲差異表達(dá)結(jié)果，使用EBseq進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組間的差異分析。將FDR（False discovery rate）＜0.05且差異倍數(shù)FC（Fold change）＞2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 春尺蠖嗅覺受體蛋白ORs基因鑒定

共鑒定到13個潛在的春尺蠖嗅覺蛋白受體ORs蛋白基因，分別命名為AcinOR1~AcinOR13。等電點預(yù)測結(jié)果范圍在4.42~10.03之間，等電點小于7.00的氨基酸分別為AcinOR2、AcinOR9和AcinOR11，顯酸性，其他基因氨基酸的等電點均大于7.00，且大多數(shù)氨基酸的等電點在9.00左右，顯堿性；分子量范圍為7.91~47.32 kDa，其中，AcinOR2、AcinOR5、AcinOR10、AcinOR11和AcinOR12這5個基因氨基酸的分子量小于20.00 kDa，其他基因分子量都在40.00 kDa左右；預(yù)測得知AcinOR在N端均無信號肽（表1）。

表1ORs基本信息統(tǒng)計表Tab.1 Statistical table of basic information of ORs

2.2 春尺蠖嗅覺受體ORs序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

春尺蠖嗅覺受體蛋白之間的相似度較低，但所有基因均含有一段保守的區(qū)域，其序列一致性為13.45%（圖1）。

圖1 春尺蠖嗅覺受體蛋白ORs基因氨基酸的序列比對Fig.1 Sequence alignment of amino acids of olfactory receptor protein ORs gene of Apocheima cinerarius

構(gòu)建了由國槐尺蠖（Semiothisa cinerearia）、茶尺蠖（Ectropis obliqua）、二化螟（Chilo suppressalis）、家蠶（Bombyx mori）和棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）等5種鱗翅目昆蟲的98個ORs構(gòu)成的春尺蠖嗅覺受體蛋白ORs基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。這些基因在進(jìn)化上存在較大差異，其中，同源性較高的基因被聚類在一起，共有2對ORs聚集到同一分支上，分別為AcinOR2/AcinOR5/AcinOR13、AcinOR13/AcinOR7，同時AcinOR1/BmorOR10、AcinOR4/HarmOrco、AcinOR10/EoblOR4、AcinOR3/EoblOR29和AcinOR8/ScinOR5聚在一支上（圖2）。

圖2 春尺蠖嗅覺受體蛋白ORs基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic tree relationship of olfactory receptor protein ORs gene in Apocheima cinerarius

2.3 春尺蠖ORs基因在雌雄成蟲的差異表達(dá)分析

在本實驗室前期已測轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共篩選鑒定獲得13個普通受體，經(jīng)差異分析得到3個表達(dá)差異受體基因。這3個差異受體基因ORs均呈偏向性表達(dá)，總體來看ORs在雌蟲中的表達(dá)量高于雄蟲，3個受體基因中AcinOR6和AcinOR9在雌性個體的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雄性個體，只有AcinOR1在雄蟲中的表達(dá)量略高于雌蟲（圖3）。

圖3 春尺蠖嗅覺受體性別差異表達(dá)量Fig.3 Sex difference expression levels of olfactory receptors in Apocheima cinerarius

3 討論與結(jié)論

近年來，轉(zhuǎn)錄組測序廣泛應(yīng)用于植物、動物以及真菌等各項研究［8，18-19］。筆者對前期已測春尺蠖成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，共獲取13個潛在ORs基因，分別命名為AcinOR1~AcinOR13。13個嗅覺受體基因的序列一致性為13.45%，序列一致性較低的原因可能由于除AcinOR3外，其余受體基因均不是全長。通過在線信號肽預(yù)測，13個受體基因均未發(fā)現(xiàn)信號肽，這可能與受體基因為非分泌蛋白有關(guān)，同時還需要進(jìn)一步確定其受體基因的身份。

為明確春尺蠖嗅覺受體蛋白的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了由茶尺蠖、國槐尺蠖、家蠶、二化螟和棉鈴蟲5種同鱗翅目的98個ORs構(gòu)成的春尺蠖嗅覺受體蛋白ORs的系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AcinOR2/AcinOR5/AcinOR13、AcinOR13/AcinOR7分別聚在一支上，同時AcinOR1/BmorOR10、AcinOR4/HarmOrco、AcinOR10/EoblOR4、AcinOR3/EoblOR29和AcinOR8/ScinOR5聚在一支上，說明嗅覺受體基因不僅具有保守性，同時具有物種的特異性［20］。

嗅覺系統(tǒng)在昆蟲的交配、定位寄主、尋找產(chǎn)卵地點、避免有害因素等行為中起著至關(guān)重要的作用［21］。昆蟲雌性個體因其生理差異，嗅覺相關(guān)基因也會出現(xiàn)性別差異性表達(dá)，即偏向性表達(dá)。筆者在鑒定得到的13個普通受體基因中共發(fā)現(xiàn)3個差異嗅覺受體差異基因，且均呈現(xiàn)偏向性表達(dá)，其中，AcinOR6和AcinOR9呈現(xiàn)雌性高表達(dá)，說明它們可能在識別產(chǎn)卵位點中具有作用，而AcinOR1呈現(xiàn)雄性高表達(dá)，表明它們在識別雌性信息素和交配行為中具有一定作用［22-23］。