低頻超聲輻照載5-氟尿嘧啶的納泡靶向治療裸鼠射頻消融后殘留肝癌的效果

李紅陽，唐詩聰，趙公芳，牛英杰，李喬亞

1昆明醫科大學第三附屬醫院肝膽外科，昆明 650000；2昆明醫科大學第二附屬醫院消化內科，昆明 650000；3昆明醫科大學附屬延安醫院全科醫學科，昆明 650000

射頻消融(radiofrequency ablation，RFA)是無創性治療中晚期肝癌的新方法，其優點包括原位滅活腫瘤、創傷小、恢復快、僅需局部麻醉、無瘢痕、并發癥少等，但同時也存在一些缺陷：由于肋骨遮擋，導致RFA的治療效率降低；肝癌血供豐富，造成RFA熱沉積效率低，聚焦點能量低，從而導致治療效果較差；肝臟隨呼吸運動，可能導致射頻定位不準確，從而出現治療盲區，造成殘癌的存在[1-3]。超聲波靶向爆破攜藥物/基因納泡技術(ultrasound targeted nanobubble destruction，UTND)是指當攜藥物/基因的納泡造影劑經靜脈注射進入腫瘤組織時，可通過超聲波產生的空化效應及機械效應，擊碎攜藥物/基因的納泡造影劑，使外源性藥物/基因進入腫瘤組織，從而徹底殺滅殘余癌細胞，目前該技術已成為腫瘤治療的研究熱點[4-5]。從理論上講，載藥的納泡治療系統聯合RFA可彌補射頻治療的不足，在肝癌治療方面具有較好的應用前景，但目前研究尚少。本研究構建了RFA治療后殘余肝癌裸鼠模型，并合成包裹5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)的納泡，采用低強度低頻超聲輻照載5-FU的納泡，靶向治療殘余肝癌，分析其對RFA不完全肝癌細胞的抑制作用，以期為肝癌的無創或微創治療提供新方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞 60只6～8周齡BALB/c裸鼠，體重(18±2) g，雌雄不限，購自昆明醫科大學實驗動物中心，混合飼料，隔籠喂養；人肝癌HepG2細胞購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。實驗過程符合國家及單位有關實驗動物的管理和使用規定。

1.2 主要儀器及試劑 DZC型低頻超聲輻照儀(重慶醫科大學超聲研究所研制)；普通超聲儀(德國Siemens公司)；752型紫外分光光度儀(日本島津公司)；Cool-tip射頻消融系統(美國Valleylab公司)；CKX41倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；3000SSA型Malvern激光粒徑測量儀、Zata電位檢測儀(英國Malvern公司)；二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、多聚賴氨酸(美國Sigma公司)；二棕櫚酰磷脂酰磷脂酸(瑞士Genzyme公司)；RPMI 1640(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；1:50鼠抗人CD34單克隆抗體(北京中杉生物公司)；SP免疫組化試劑盒(上海碧云天試劑公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.3 方法

1.3.1 合成包裹5-FU的納泡 將二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰磷脂酸按合適的濃度混合，加0.5 ml PBS稀釋，制成納泡造影劑。采用親和素-生物素技術將納泡與5-FU有效結合，制成包裹5-FU的納泡。

1.3.2 裸鼠移植瘤模型的建立 使用RPMI 1640培養基將處于對數生長期的人肝癌HepG2細胞稀釋成濃度為1×108/ml的細胞懸液，通過臺盼藍拒染試驗檢測其細胞活性＞90%。于60只裸鼠右側背部皮下注射0.2 ml的細胞懸液，密切觀察腫瘤生長情況，6 d后腫瘤形成，直徑達0.5～1.0 cm，超聲檢查成瘤率為100%。

1.3.3 分組及治療 裸鼠處于仰臥位，用18G穿刺針垂直腫瘤長軸方向刺入腫瘤中心，超聲引導下采用Cool-tip射頻消融系統進行冷循環RFA(射頻功率30 W，持續消融時間10 s)，消融后用超聲探查肝癌平均消融約80%。按隨機數字表法將60只荷瘤裸鼠均分為生理鹽水組、載5-FU納泡(5-FU)組、非低頻超聲輻照載5-FU納泡(非低頻超聲+5-FU)組、低頻超聲輻照載5-FU納泡(低頻超聲+5-FU)組4組，每組15只。后3組裸鼠經尾靜脈注入包裹5-FU的納泡(0.1 μg/μl)，每次200 μl，每3 d注射1次，連續注射3次。生理鹽水組注入等體積生理鹽水；非低頻超聲+5-FU組輻照頻率為2.5 MHz，聲強為5 W/cm2，輻照時間5 min；低頻超聲+5-FU組注入納泡后采用超聲監測微泡到達靶組織的情況，調整輻照頻率為1.0 MHz，聲強為2 W/cm2，輻照時間5 min。

1.3.4 TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡情況 整個治療結束后第5天，每組各處死5只荷瘤裸鼠，取其腫瘤組織，固定后常規石蠟包埋，切片4 μm；經常規脫蠟、水化等操作后，加入TUNEL反應混合液，置于37 ℃孵育1 h。按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書，采用TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡指數。凋亡率(%)=陽性細胞數/腫瘤細胞總數×100%。陽性細胞判定標準：腫瘤細胞的細胞核呈棕褐色。

1.3.5 CD34-MVD法檢測腫瘤內新生血管密度 按1.3.4中的步驟處理腫瘤組織切片，用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)處理，于121 ℃環境中高壓滅菌18 min，自然冷卻后用PBS沖洗3次，每次5 min；用3%H2O2保持5 min，PBS沖洗3次，每次5 min；然后將切片用抗CD34抗體免疫染色并用DAB處理；洗滌、復染、脫水等。用免疫組化Elivison二步法觀察CD34陽性微血管：首先使用低倍(40～100倍)物鏡觀察染色最強的區域(熱點)，然后使用高倍(200～400倍)物鏡對染色的血管進行計數，計算平均微血管密度(MVD)。

1.3.6 荷瘤裸鼠生長情況觀察 除去處死的荷瘤裸鼠，觀察各組剩余荷瘤裸鼠(每組各10只)的生長情況，包括日常活動情況，進食及飲水情況，毛發、營養及腫瘤轉移情況等。在治療后的第7、14、21、28天，通過二維超聲測量各組移植瘤的最長徑(L)及最短徑(W)，并計算腫瘤體積(V)。V=(L×W2)/2。按如下公式計算實體瘤生長抑制率(TGIR)。TGIR(%)=(1－治療組平均腫瘤體積/生理鹽水組平均腫瘤體積)×100%。同時記錄各組裸鼠的存活時間，繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.4 統計學處理 采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Kaplan-Meier法分析各組的生存時間。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組荷瘤裸鼠生長情況 經治療后，各組荷瘤裸鼠均表現出不同程度的體重減輕、活動減少、食欲減退等，其中低頻超聲+5-FU組的荷瘤裸鼠生長情況明顯優于其他3組。

2.2 各組荷瘤裸鼠腫瘤大小比較 各組裸鼠腫瘤體積均隨時間延長而逐漸增大，但低頻超聲+5-FU組的腫瘤生長速度明顯低于其他3組，生長抑制率亦明顯低于5-FU組與非低頻超聲+5-FU組，差異均有統計學意義(P＜0.05，表1)。

表1 各組荷瘤裸鼠治療后腫瘤體積變化(±s，n=10)Tab.1 Comparison of tumor volume after treatment among four groups (±s, n=10)

表1 各組荷瘤裸鼠治療后腫瘤體積變化(±s，n=10)Tab.1 Comparison of tumor volume after treatment among four groups (±s, n=10)

與生理鹽水組比較，(1)P＜0.05；與5-FU組比較，(2)P＜0.05；與非低頻超聲+5-FU組比較，(3)P＜0.05

組別腫瘤體積(mm3)生長抑制率(%)治療后第7天治療后第14天治療后第21天治療后第28天生理鹽水組744.5±49.9870.9±72.01062.5±122.11467.2±127.9-5-FU組618.5±48.4(1)705.9±57.9(1)895.1±90.1(1)1204.0±112.2(1)18.06±2.93非低頻超聲+5-FU組568.2±43.8(1)(2)672.4±53.2(1)830.6±77.2(1)1142.3±101.7(1)22.20±3.69(2)低頻超聲+5-FU組411.1±32.6(1)(2)(3)496.5±36.3(1)(2)(3)618.3±59.6(1)(2)(3)833.3±70.6(1)(2)(3)43.24±2.23(2)(3)F 97.48975.02242.08761.626462.482 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 荷瘤裸鼠生存時間比較 低頻超聲+5-FU組荷瘤裸鼠生存時間明顯長于其他3組，差異有統計學意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 各組荷瘤裸鼠生存曲線Fig.1 The survival time of tumor-bearing in nude mice

2.4 各組腫瘤細胞凋亡情況比較 T U N E L法結果顯示，低頻超聲+5-F U 組腫瘤細胞凋亡指數(4 3.2%±4.4%)＞非低頻超聲+5-F U 組(31.3%±4.3%)＞5-FU組(20.7%±2.9%)＞生理鹽水組(10.8%±2.4%)，差異有統計學意義(F=74.549，P＜0.05，圖2)。

圖2 各組殘留肝癌細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of residual tumor cell in each group

2.5 各組腫瘤內新生血管密度比較 低頻超聲+5-FU組瘤體中無明顯CD34染色陽性區，其余各組瘤體中見多個CD34染色陽性區，陽性染色的腫瘤組織較多。低頻超聲+5-FU組MVD[(8.9±1.3)個/HP]＜非低頻超聲+5-FU組[(20.1±3.2)個/HP] ＜5-FU組[(25.0±4.2)個/HP] ＜生理鹽水組[(29.9±2.0)個/HP]，差異有統計學意義(F=48.667，P＜0.05，圖3)。

圖3 各組殘留肝癌組織內新生血管密度比較Fig.3 Comparison of neovascularization density in residual tumor tissues of each group

3 討 論

我國肝癌發病率居全球之首，每年新發及死亡患者約占全球總數的一半[6-7]。盡管近年來肝癌根治性切除術得到了長足發展[8]，且術中嚴格遵循了無瘤原則，但由于術中擠壓、搬動、腫瘤細胞微轉移及肝癌本身進展等多種因素的作用，術后復發往往無法避免，多數肝癌患者死于腫瘤復發轉移[9]，即使是完全規范的治療，5年生存率也僅為47%[10]。小肝癌的5年生存率僅為70%，而復發轉移率卻高達64%[11]。Shah等[12]認為，血管侵犯是肝癌根治性切除術后1年內復發的最高危因素，主要包括肝內大血管及微血管的侵犯。李傳紅等[13]發現，術前甲胎蛋白高水平、乙型肝炎病毒陽性、腫瘤數目多及吲哚氰綠15 min儲留率(ICGR15)高是肝癌行根治性切除術后復發的高危因素。Melcher等[14]認為，腫瘤分化程度及血管侵犯也是肝癌患者行肝移植術后復發及生存率的獨立影響因素。

納米載藥系統具有良好的靶向性、可控釋性、生物相容性及物理穩定性，已成為當今臨床醫學研究最熱門的方向之一[15-17]。UTND技術是攜藥物的納泡經靜脈注入體內后，當超聲儀監測到微泡到達靶組織時，以超聲波爆破微泡產生“空化效應”“聲孔效應”，提高細胞膜的通透性，促使更多藥物通過細胞膜進入靶組織，從而達到藥物的治療效果[18-19]。目前UTND技術使用的超聲儀主要是普通超聲儀，其發出的連續波并不利于載藥微泡在靶組織器官的灌注，從而導致達到靶向部位的藥物量較低，而且對正常組織也會產生一系列的生物學效應[20-22]。此外，通過普通超聲儀對載藥微泡進行輻照不能從真正意義上保證體內定位的精確性，在很大程度上降低了載藥微泡的治療效果。低強度聚焦超聲遵循聚焦超聲原理，其能量遠遠低于高強度聚焦超聲，不會產生破壞性的致熱反應[23-25]。

本研究選用重慶醫科大學超聲影像學研究所自制的低強度聚焦超聲作為超聲觸發設備，通過低強度聚焦超聲爆破載藥納泡，提高藥物在靶組織的靶向性沉積，并通過降低正常組織的不良反應來提高治療效果(圖4)。本研究結果顯示，低頻超聲+5-FU組的腫瘤生長體積明顯小于其他3組，生存時間及凋亡指數也明顯高于其他3組，腫瘤MVD值明顯低于其他3組，差異有統計學意義(P＜0.05)，其機制可能是低頻超聲波爆破納泡產生的“機械效應”使內皮細胞膜發生損傷，導致微血栓形成，栓塞腫瘤血管的血液供應，使MVD降低，引起局部腫瘤細胞壞死。此外低頻超聲爆破納泡產生的“空化效應”可增加血管膜通透性，促進5-FU的吸收，使5-FU更容易進入細胞內殺滅腫瘤細胞，促進更多的肝癌細胞凋亡，進而使腫瘤體積縮小，控制腫瘤的生長，從而達到治療效果。

圖4 低頻超聲輻照載5-氟尿嘧啶的納泡Fig.4 Low frequency ultrasound radiation 5-fluorouracil loaded nanobubbles

綜上所述，低頻超聲輻照載5-FU的納泡治療RFA后裸鼠殘留肝癌時，可明顯降低肝癌組織內的MVD，抑制腫瘤生長。隨著低頻超聲輻照載藥納泡靶向藥物釋放技術在腫瘤治療方面研究的深入，有望為肝癌提供更加安全、高效，靶向性更強的局部定位控釋治療方法。此外，本研究雖然在一定程度上證實了低頻超聲輻照載5-FU的納泡對RFA殘留肝癌細胞的抑制作用，有望為肝癌無創或微創治療提供新方案，但低頻超聲輻照載5-FU納泡的最佳時間參數，以及低頻超聲輻照載5-FU的納泡對RFA殘留的肝癌細胞的具體作用機制等仍需進一步深入研究。