CYFIP2在腎透明細胞癌細胞增殖及遷移中的作用

安哲昆，李修彬，藺晨雨，郭欣鑫，成曉龍，蔡明

1山西醫科大學基礎醫學院，太原 030001；2解放軍總醫院第八醫學中心呼吸學部研究所，北京 100091；3浙江大學醫學院附屬第二醫院泌尿外科，杭州 310009；4解放軍總醫院第三醫學中心泌尿外科學部，北京 100143

腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)是腎癌最常見的病理類型[1]，占全部腎癌的80%～85%[2-3]，雖然其惡性程度較低，但由于腎臟屬于代償功能較強的實質性器官，因此常起病隱匿[4]，其中20%～25%的患者在確診時已出現遠處轉移[5]。在臨床上，KIRC常與顆粒細胞癌及梭形細胞癌混合存在，腫瘤分級較困難，現有的治療手段主要為腎癌根治性切除和對癥、支持治療，靶向治療手段較為局限。因此，尋找新的有效生物標志物和治療靶點具有十分重要的現實意義。FMR1-相互作用蛋白-2(CYFIP2)基因的編碼產物主要定位在胞質及質膜，是一種新型的p53介導的促凋亡蛋白(又稱p53誘導蛋白121)[6]，胃癌患者的CYFIP2轉錄水平明顯低于癌旁組織[3,7]。目前絕大多數研究立足于CYFIP2基因的生物學功能，而其在細胞增殖活性及遷移方面的作用研究較少，在KIRC中的研究亦相對匱乏。本研究分析了CYFIP2基因在KIRC組織中的表達水平及與患者預后的關系，并檢測敲低及過表達CYFIP2基因后786-O細胞增殖活性及遷移能力的變化，旨在探討CYFIP2基因對KIRC生物學特性的影響，并為進一步探索KIRC新的診療靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 KIRC細胞系786-O細胞由中國科學院北京基因組研究所劉江課題組贈送。RPMI 1640培養基、PBS、胎牛血清(FBS)購自以色列BI公司，青霉素-鏈霉素-新霉素抗生素混合試劑(Psn)購自美國Gibco公司；CYFIP2-靶特異性siRNA(si-CYFIP2)及陰性對照siRNA-NC由賽默飛世爾科技中國有限公司合成，為避免脫靶，本實驗共設計3條CYFIP2基因干擾RNA序列，即siRNA1：GAGUAGAGAUCUAUGAGAAdTdT，siRNA2：GCAAGUUCAUCAACAUGUUdTdT，siRNA3：GAGAAUUAAUCUUAGCAAAdTdT。陰性對照病毒CON335(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRESpuromycin)、CYFIP2基因過表達病毒LV-CYFIP2、嘌呤霉素(puromycin)及HitransG病毒感染試劑均購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix試劑盒及iScript cDNA Synthesis試劑盒均購自美國Bio-Rad公司，JET PRIME轉染試劑盒購自法國Poly Plus公司，Cell Count Kit 8(CCK-8)試劑盒購自北京蘭博利德商貿有限公司，Trizol細胞裂解液購自美國Ambion公司，12孔板、96孔板、培養皿及離心管等耗材均購自美國康寧公司。

1.2 CYFIP2基因相關預后數據的獲取及分析檢索TCGA-RNA Sequencing數據庫及GEPIA信息庫(http://gepia.cancer-pku.cn)并提取CYFIP2基因在KIRC組織及正常組織的表達信息，共獲取529例KIRC患者的KIRC組織的CYFIP2基因表達信息，另取此529例KIRC患者中71例的癌旁組織作為對照。利用ALCA數據庫分析CYFIP2基因表達量與臨床特征及預后的關系。然后，以TCGA數據庫和GEPIA信息庫構建UALCAN可視化平臺，在此平臺中以TCGA-RNA Sequencing數據集檢索CYFIP2，數據庫選項選擇腎透明細胞癌；分別對腫瘤分級、TNM分期、淋巴轉移及遠處轉移等臨床特征分組及預后情況進行分析。最后利用GEPIA數據庫合并TCGA數據集，應用survival選項分析CYFIP2表達水平差異與患者生存時間的Kaplan-Meier曲線。

1.3 786-O細胞分組情況 將786-O細胞分別轉染si-CYFIP2-1、si-CYFIP2-2、si-CYFIP2-3三種si-RNA進行敲低效率檢測，選擇敲低效果最好的si-RNA進行后續實驗(下文稱si-CYFIP2)。實驗分組：將CYFIP2基因敲低后的786-O細胞作為敲低組(si-CYFIP2)組并設置相應對照組si-NC；另將進行CYFIP2基因過表達后的786-O細胞作為過表達組(OE-CYFIP2)，并設置相應對照組OE-NC。

1.4 786-O細胞轉染構建敲低體系 取對數生長期的786-O細胞，以5×104個/孔接種于12孔板，在37 ℃、5% CO2條件下，于RPMI 1640培養基中培養至融合度達70%，棄去培養基，PBS洗1次；依照JET PRIME轉染試劑盒說明書加入轉染體系100 μl/孔(配比為94 μl Buffer、2.3 μl si-RNA、3.7 μl JET試劑)，24 h后換液，干擾表達效果可維持3～5 d。

1.5 慢病毒感染786-O細胞構建過表達體系 向6孔板中加入RPMI 1640完全培養基(4% Hitrans GA、10%FBS)，取對數生長期的786-O細胞，以1×105個/孔接種于6孔板，待融合度達20%～40%后換液，以感染復數(MOI)=5的比例分別加入陰性對照病毒CON335及LV-CYFIP2病毒，8～16 h棄去培養基，PBS洗1次；加入無病毒及增強劑的RPIM 1640完全培養基，24 h后觀察細胞狀態；每毫升培養基加入1 μg嘌呤霉素，3～5 d持續觀察細胞狀態，根據細胞生長狀態每2 d換液1次。

1.6 細胞增殖-毒性實驗檢測786-O細胞增殖活性

將786-O細胞以5×103個/孔接種于96孔板培養，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，待融合度達50%左右時，培養24～72 h后棄去培養基，PBS洗1次，加入新培養基后，每孔分別加入CCK-8試劑10 μl，輕輕混勻后于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中孵育2 h，采用酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度(OD)值。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析786-O細胞CYFIP2基因表達水平 取對數生長期的786-O細胞，以5×104個/孔接種于12孔板，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24～36 h，待融合度達40%～70%時，棄去培養基，PBS洗1次；采用Trizol裂解液充分裂解細胞后提取總RNA，使用iScript cDNA Synthesis試劑盒及iTaq Universal SYBR Green Supermix試劑盒對提取的RNA進行反轉錄。利用Primer Bank數據庫查詢并設計CYFIP2引物，上游引物5＇-TCCAACGTGGACCTGCTT-3＇，下游引物5＇-GGACTGTAGCCTGCTCAATG-3＇；內參照GAPDH上游引物5＇-TGCACCACCAACTGCTTAG-3＇，下游引物5＇-GATGGAGGGATGATGTTC-3＇。然后利用qRT-PCR分析786-O細胞CYFIP2基因敲低及過表達水平。

1.8 細胞克隆形成實驗分析786-O細胞增殖活性

取處理后的786-O對數生長期細胞，以500個/孔接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中孵育8～10 d，待出現肉眼可觀測到直徑100 μm左右的單細胞克隆時棄去培養基，PBS洗2次；然后于甲醇溶液中固定細胞15 min，棄去甲醇溶液，每孔加入300 μl 0.5%結晶紫溶液對細胞克隆染色10 min，棄去染液，PBS清洗2次，進行細胞克隆計數并分析。

1.9 Transwell細胞遷移實驗分析786-O細胞遷移能力 用0.25%胰酶溶液消化經血清饑餓24 h的786-O對數生長期細胞，制備單細胞懸液，以1000 r/min(離心半徑為7.59 cm)離心5 min后，用無FBS的RPMI 1640培養基重懸細胞并計數，取Transwell小室置于24孔板，加入200 μl細胞密度為1.25×105個/ml的細胞懸液，然后將小室分別置于700 μl含10%胎牛血清的RPIM 1640完全培養基的24孔板中，37 ℃、5%CO2恒溫培養箱培養24及48 h后取出Transwell小室，用甲醇固定細胞，0.1%結晶紫染色。顯微鏡下采集圖像，以Photoshop軟件對遷移細胞進行計數。

1.10 統計學處理 采用GraphPad Prism 8軟件對數據進行統計分析。計量資料以表示，符合方差齊性，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例(%)表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CYFIP2基因在KIRC中的表達及其對生存預后的影響 從TCGA-RNA Sequencing數據庫獲取的529例KIRC患者的臨床病理信息見表1。生物信息學分析顯示，與癌旁組織比較，KIRC組織中的CYFIP2 mR NA表達水平明顯下調(t=26.96，P＜0.01，圖1 A)。進一步分析在腫瘤不同分期和分級中CYFIP2 mRNA表達水平的差異，結果顯示，隨腎癌病理分級及分期進展，CYFIP2基因表達水平逐漸降低(F分級=7.979，P＜0.01；F分期=6.883，P＜0.01，圖1 B、C)；隨原發腫瘤浸潤程度加深(T 分期進展)，C Y F I P 2 基因表達水平也呈降低趨勢(F=6.378，P＜0.01，圖1D)；發生淋巴結轉移患者的KIRC樣本中CYFIP2基因表達豐度明顯低于未發生淋巴結轉移者(t=2.212，P＜0.05，圖1E)；發生遠處轉移患者的KIRC樣本中CYFIP2表達水平明顯低于未發生轉移者的樣本(t=2.965，P＜0.01，圖1F)。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，CYFIP2高表達的患者生存期長、存活率高(P＜0.01)，5年存活率為75%，而CYFIP2低表達的患者5年存活率不足60%(圖1G)。

圖1 CYFIP2基因在KIRC中的表達及其對預后的影響Fig.1 Effect of CYFIP2 gene expression in KIRC and on the prognosis of KIRC

表1 KIRC患者臨床病理信息(n=529)Tab.1 Clinicopathological information of patients with renal clear cell carcinoma (n=529)

2.2 C Y F I P 2 基因敲低及過表達后7 8 6-O 細胞CYFIP2基因表達水平的變化 RT-PCR結果顯示，在敲低CYFIP2基因后，786-O細胞中CYFIP2基因的表達水平降至30%左右(t1=4.308，P＜0.01；t2=5.183，P＜0.01；t3=5.024，P＜0.01，圖2A)，其中si-CYFIP2-2的敲低效果最佳，因此，后續采用siRNA-CYFIP2-2進行實驗(下文稱si-CYFIP2)。慢病毒感染786-O細胞(MOI=5)過表達CYFIP2基因后，經puromycin篩選后得到OE-NC組和OE-CYFIP2組的細胞(圖2B)；OE-CYFIP2組786-O細胞的CYFIP2基因表達水平明顯上調，較OE-NC組約提高12倍(t=17.10，P＜0.01，圖2C)。

圖2 CYFIP2基因表達水平改變情況及慢病毒感染情況Fig.2 Altered CYFIP2 gene expression levels and lentivirus infection

2.3 CYFIP2基因表達水平改變后對786-O細胞增殖活性及克隆形成能力的影響 與si-NC組比較，si-CYFIP2組48 h和72 h時786-O細胞增殖活性明顯升高(t48h=9.143，P＜0.0001；t72h=-219.951，P＜0.0001，圖3A)；與OE-NC組比較，OE-CYFIP2組的增殖活性在24 h、48 h和72 h時明顯降低，差異有統計學意義(t24h=31.44，P＜0.01；t48h=16.540，P＜0.0001；t72h=47.59，P＜0.0001，圖3B)。細胞克隆形成實驗表明，與si-NC組比較，si-CYFIP2組786-O細胞的克隆形成能力明顯增強，細胞克隆形成集落明顯增多，差異有統計學意義[(59.5±7.8)個/視野vs. (31.5±0.7)個/視野，t=-5.07，P＜0.0001)；與OE-NC組比較，OE-CYFIP2組克隆形成集落數明顯減少，克隆形成能力明顯減弱[(22.0±0.8)個/視野vs. (43.5±1.3)個/視野，t=-5.07，P＜0.0001)(圖3C、D)。

圖3 CYFIP2基因敲低及過表達后786-O細胞增殖活性及克隆形成情況Fig.3 Proliferation viability and clone formation of 786-O cells after CYFIP2 gene knockdown and overexpression

2.4 CYFIP2基因表達水平改變對786-O細胞體外遷移能力的影響 Transwell實驗結果顯示，786-O細胞敲低CYFIP2基因后，與si-NC組比較，si-CYFIP2組24 h和48 h的細胞遷移數目均明顯增多，遷移能力明顯增強[(66.8±2.21)個/視野vs. (43.0±2.6)個/視野，t24h=13.96，P＜0.0001；(187.3±22.3)個/視野vs. (108.7±10.8)個/視野，t48h=5.505，P＜0.01，圖4A]；786-O細胞過表達C YFIP2基因后，與OE-NC組比較，OE-CYFIP2組24 h和48 h時細胞遷移數目明顯減少，遷移能力明顯降低[(38.7±1.5)個/視野vs. (60.3±2.5)個/視野，t24h=12.75，P＜0.001；(129.7±2.5)個/視野vs. (201.0±5.3)個/視野，t48h=21.09，P＜0.0001，圖4B]。

圖4 CYFIP2基因敲低(A)及過表達(B)對786-O細胞體外遷移能力的影響(Transwell ×20)Fig.4 Changes of migration ability in vitro of 786-O cells 24 h and 48 h after CYFIP2 knockdown or overexpression (Transwell ×20)

3 討 論

關于CYFIP2基因的現有研究不僅揭示了其對神經發育及線粒體生物學功能的重要影響[8]，同時顯示了其在腫瘤生物學特性方面的重要功能。CYFIP2與CYFIP1為同源基因，但與后者不同的是，前者可與3個脆性X智力低下蛋白(FMRP)發生相互作用[9]。CYFIP2基因在肺癌細胞中作為p53的候選靶基因發揮協同作用，與Akt競爭性結合膜脂，從而抑制Akt的活化[10-11]，進一步增強肺癌細胞的凋亡。但CYFIP2并不能直接誘導和激活肺癌細胞凋亡，而是通過發揮p53依賴的協同作用實現的[12-13]。值得注意的是，在體外研究中利用siRNA對CYFIP2進行敲低后未能阻斷p 5 3 依賴的細胞凋亡[14]；而在胃癌細胞中，NDRG1作為p53的另一個靶基因，在CYFIP2基因表達受到抑制后，可繼續間接介導細胞凋亡[15]；提示在p53依賴的細胞凋亡通路中CYFIP2并非唯一的調節因素[16-17]。在結直腸癌細胞中，CYFIP2同樣可作為促凋亡蛋白直接增加細胞凋亡，過表達CYFIP2后caspase-3及其下游PARP生物信號增強[13]。還有體外實驗發現，抑制BGC-823胃癌細胞CYFIP2基因的表達可緩解5-氟尿嘧啶介導的Akt信號抑制效應[16]，但尚無明確證據提示在胃癌發生發展過程中CYFIP2與Akt之間存在直接的功能交互作用。

在腫瘤細胞增殖活性方面，敲低CYFIP2基因后胃癌細胞的增殖活性明顯增強[10]，但對腫瘤發生發展過程中該基因的具體作用機制尚不明確。MGC-803及SGC-7901胃癌細胞系敲低CYFIP2基因后，其惡性增殖能力及成瘤性明顯增強。此外，CYFIP2基因表達水平低下時，結腸癌細胞K-Ras的表達增強[18]。K-Ras作為一種致癌蛋白，在腫瘤的生成、增殖遷移及血管生成方面均具有重要的生物學效應，可影響癌癥的進展[19-20]。研究發現，在小鼠模型中K-Ras可條件性激活胃鱗狀上皮細胞增殖，進一步誘導胃癌癌前病變[21-22]，提示CYFIP2基因敲低誘導的胃癌細胞增殖可能與K-Ras表達增強有關。

CYFIP2基因與肌動蛋白(WASP)動力學和突觸前線粒體活性調節相關[23-24]。一項針對脆性X綜合征(fragile X syndrome，FXS)患者的研究發現，其核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)的水平升高，且作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)調節因子的磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶(pAkt)和CYFIP2的表達水平也升高，進而出現肌動蛋白WASP家族Verprolin同源蛋白(WAVE)的活性上調[25]，而WAVE復合物已被證實在乳腺癌及胰腺癌的腫瘤細胞遷移中發揮著重要作用[26-27]。

本研究通過si-RNA轉染及慢病毒感染改變CYFIP2基因的表達水平后，通過RT-PCR等實驗證實了786-O細胞中的CYFIP2基因敲低后其表達水平降至30%，而過表達后CYFIP2基因的表達水平則提高了12倍。進一步結合臨床預后數據分析對CYFIP2基因在KIRC細胞系中的生物學效應作出假設，且在后續的體外實驗中利用CCK-8及細胞克隆形成實驗證實，干擾786-O細胞CYFIP2基因表達后，腫瘤細胞的增殖活性及克隆形成能力明顯提高，但過表達CYFIP2基因后，786-O細胞的增殖活性及克隆形成能力明顯受到抑制。筆者推測該基因對于KIRC增殖活性的調節作用可能與其參與胞內能量代謝活動有關，其機制可能與調控Akt-mTOR信號通路活性相關[9-10]。此外，本研究Transwell實驗結果顯示，CYFIP2基因表達降低可促進786-O細胞遷移，而在786-O細胞中過表達CYFIP2基因后細胞遷移能力明顯降低，其機制可能由CYFIP2基因調節相關分子磷酸化水平來實現，但CYFIP2在KIRC中的具體作用機制仍需進一步探討。

綜上所述，本研究結果顯示，CYFIP2基因參與了腫瘤細胞的增殖及遷移等生物學進程，在KIRC患者腫瘤組織中CYFIP2基因的表達水平低于癌旁組織，隨KIRC病理分級和分期進展CYFIP2表達水平明顯降低，CYFIP2高表達的患者具有高的生存率及長的存活期。本研究豐富了CYFIP2基因及KIRC的相關基礎研究，為后續研究提供了新的線索和思路，但數據及分析僅表明CYFIP2基因參與了KIRC的增殖及轉移，且與患者預后存在潛在關聯，而其具體作用靶點及機制仍有待進一步研究。