雞屎藤苷酸誘導SGC7901胃癌細胞凋亡并抑制細胞惡性增殖和侵襲

郭強　李井野　王威　兆勇

摘要目的：初步探索雞屎藤苷酸（PA）誘導SGC7901胃癌細胞凋亡并抑制細胞惡性增殖和侵襲的可能機制。方法：選取SGC7901胃癌細胞為研究對象，利用CCK8法進行濃度梯度實驗確定后續實驗濃度，利用流式細胞術檢測0、20、40、80 μg/mL的PA處理后SGC7901胃癌細胞凋亡率以及線粒體膜電位變化情況，BrdU法和Transwell小室實驗SGC7901胃癌細胞的增殖活性以及侵襲能力，qRTPCR檢測抑癌基因P53、P21的mRNA相對表達水平，Western Blotting檢測凋亡相關蛋白Bcl2、Bax、Caspase3、cMyc和轉移相關蛋白VEGF、波形蛋白表達水平。結果：CCK8梯度濃度試驗發現PA濃度從40 μg/mL開始對SGC7901胃癌細胞活性產生了明顯抑制作用（P<0.05），后續以20、40、80 μg/mL為試驗濃度;與0 μg/mL的PA處理比較，40、80 μg/mL的PA處理后SGC7901胃癌細胞凋亡率、Bax/Bcl2、CleavedCaspase3/Caspase3蛋白表達水平以及P53、P21相對表達量升高，線粒體膜電位、細胞增殖活性、侵襲率、cMyc、VEGF、波形蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義（均P<0.05）。結論：PA可能通過降低線粒體膜電位促進線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡，促進抗癌基因表達抑制細胞的惡性增殖，并抑制上皮間質轉化降低侵襲能力。

關鍵詞胃癌;SGC7901胃癌細胞;雞屎藤苷酸;惡性增殖;侵襲;轉移;凋亡;線粒體膜電位

Paederosidic Acid Induces Apoptosis of Gastric Cancer SGC7901 Cells and Inhibits

Their Malignant Proliferation and Invasion

GUO Qiang，LI Jingye，WANG Wei，ZHAO Yong

（Department of General Surgery，Benxi Central Hospital，Benxi 111027，China）

AbstractObjective：To preliminarily explore the underlying mechanism of paederosidic acid（PA） in inducing the apoptosis of gastric cancer SGC7901 cells and inhibiting their malignant proliferation and invasion.Methods：The concentration gradient test was conducted on SGC7901 cells by CCK8 to determine the subsequent experimental concentration.The changes in the apoptosis rate of SGC7901 cells and mitochondrial membrane potential（MMP） after PA treatment（0，20，40，and 80 μg/mL） were detected by flow cytometry.The proliferation activity and invasion ability of SGC7901 cells were detected by BrdU staining and Transwell assay.The relative expression levels of tumor suppressor genes（P53 and P21） were detected by qRTPCR.The expression levels of apoptosisrelated proteins（Bcl2，Bax，Caspase3，and cMyc） and metastasisrelated proteins（VEGF and vimentin） were detected by Western blot.Results：As revealed by the CCK8 concentration gradient test，PA at the concentration higher than 40 μg/mL showed inhibitory effects on the activity of SGC7901 cells（P<0.05）.The subsequent experimental concentrations were determined as 20，40，and 80 μg/mL.Compared with the results after PA treatment at 0 μg/mL，the apoptosis rate of SGC7901 cells，protein expression levels of Bax/Bcl2 and cleavedCaspase3/Caspase3，and relative mRNA expression levels of P53 and P21 increased，while MMP，cell proliferation activity，invasion rate，and protein expression levels of cMyc，VEGF，and vimentin decreased after PA treatment at 40 and 80 μg/mL（P<0.05）.Conclusion：PA may induce cell apoptosis by reducing MMP and promoting mitochondrial apoptosis pathway to promote the expression of antioncogenes，inhibit malignant proliferation and epithelialmesenchymal transition，and reduce the invasion ability.

KeywordsGastric cancer; SGC7901; Paederosidic acid; Malignant proliferation; Invasion; Metastasis; Apoptosis; Mitochondrial membrane potential

中圖分類號：R273;R735.2文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.008

胃癌是一類常見的消化系統惡性腫瘤，多以腺癌為主，根據世界衛生組織統計結果顯示，亞洲范圍內胃癌的發病率占據全球惡性腫瘤發生率的第7位，死亡率在10%左右[12]，在我國胃癌的發病率僅次于第1位的肺癌，同時胃癌死亡率在所有惡性腫瘤中排在第3位[3]。化療作為晚期胃癌患者的主要治療方式之一，通常會伴隨較為嚴重的不良反應，而對于多重耐藥的GC患者而言，化療的臨床受益極低[4]，因此尋找治療胃癌的新方法具有重要的意義。幾千年來，中醫藥在人類健康的許多領域都取得了矚目的成就，得到全世界的認可。雞屎藤Paederiascandens（Lour.）Merrill.是我國少數民族中比較常用的一味民間藥，其分布較廣，大部分分布于亞洲熱帶地區，具有較好的抗炎、鎮痛、抑菌的功效[5]，并且其環烯醚萜苷類成分提取物已被證實有較好的抗腫瘤活性[6]。但環烯醚萜苷類成分因為提取的方式不同，其種類也有較大的區別，因此具體是哪種成分發揮抗癌作用尚不清楚。本研究以SGC7901胃癌細胞為研究對象，旨在探索雞屎藤苷酸（Paederosidic Acid，PA）對SGC7901胃癌細胞凋亡、增殖以及侵襲的可能機制，為雞屎藤的開發利用提供參考依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞將已復蘇的GC7901胃癌細胞（購自中科院上海細胞庫）培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素的完全RPMI 1640培養液培養，并在37 ℃、5% CO2的加濕培養箱中培養，每2～3 d更換腫瘤細胞培養液，待細胞生長至對數期，采用0.25%胰蛋白酶消化液處理制成細胞懸液，計數后用于后續相關研究。

1.1.2藥物雞屎藤苷酸（Paederosidic Acid，PA，上海源葉生物技術有限公司，貨號：B20585）。

1.1.3試劑與儀器RPMI1640培養基、10%胎牛血清（Gibco公司，美國，貨號：23400021，10091148）;總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒（賽默飛世爾科技公司，貨號：AM1931、4368813、12574030）;CCK8試劑盒（日本同仁，日本，貨號：VC5001）;Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號：20190825）;JC1試劑盒（南京生興生物有限公司，批號：190714）;P53、P21及內參基因β肌動蛋白引物（上海生工生物工程股份有限公司，批號：191108、191025、191104）;兔抗人Bcl2、Bax、CleavedCaspase3、Caspase3、cMyc、VEGF、波形蛋白、GAPDH單克隆抗體（賽默飛世爾科技公司，貨號：14102882、336400、PA5114687、MA511521、MA1980、MA513182、MA511883、MA116757）;流式細胞儀（BD公司，美國，型號：BDFACSCalibur）;實時熒光定量PCR儀（羅氏，德國，型號：Roche LightCycler96）;正置熒光顯微鏡（NiKON，日本，型號：NiKON ECLIPSE TE2000S）。離心機（Select BioProducts公司，美國，型號：Selectspin 17R）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備

1.2.1.1CCK8法檢測細胞活性對照組：GC7901胃癌細胞（未加入PA）;觀察組：GC7901胃癌細胞+不同濃度PA（1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL）。

1.2.1.2流式細胞檢測細胞凋亡對照組：GC7901胃癌細胞（未加入PA）;觀察組：GC7901胃癌細胞不同濃度PA（根據CCK8最終結果篩選出實驗濃度，PA濃度終濃度設置為20、40、80 μg/mL）。

1.2.1.3JC1試劑盒檢測細胞膜電位變化情況對照組：GC7901胃癌細胞（未加入PA）;觀察組：GC7901胃癌細胞不同濃度PA（根據CCK8最終結果篩選出實驗濃度，PA濃度終濃度設置為20、40、80 μg/mL）。

1.2.1.4BrdU法檢測細胞增殖情況對照組：GC7901胃癌細胞（未加入PA）;觀察組：GC7901胃癌細胞不同濃度PA（根據CCK8最終結果篩選出實驗濃度，PA濃度終濃度設置為20、40、80 μg/mL）。

1.2.1.5Transwell小室試驗檢測細胞侵襲情況對照組：GC7901胃癌細胞（未加入PA）;觀察組：GC7901胃癌細胞不同濃度PA（根據CCK8最終結果篩選出實驗濃度，PA濃度終濃度設置為20、40、80 μg/mL）。

1.2.2給藥方法

1.2.2.1CCK8法檢測PA對GC7901胃癌細胞生長的影響對照組：未加入PA;觀察組：PA終濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL。

1.2.2.2流式細胞術檢測不同濃度PA對GC7901胃癌細胞凋亡的影響對照組：未加入PA;觀察組：PA終濃度分別為20、40、80 μg/mL。

1.2.2.3JC1試劑盒檢測不同濃度PA對GC7901胃癌細胞膜電位變化的影響對照組：未加入PA;觀察組：PA終濃度分別為20、40、80 μg/mL。

1.2.2.4BrdU法檢測不同濃度PA對GC7901胃癌細胞增殖的影響對照組：未加入PA;觀察組：PA終濃度分別為20、40、80 μg/mL。

1.2.2.5Transwell小室試驗檢測不同濃度PA對GC7901胃癌細胞侵襲的影響對照組：未加入PA;觀察組：PA終濃度分別為20、40、80 μg/mL。

1.2.3檢測指標與方法

1.2.3.1PA對GC7901胃癌細胞增殖影響的檢測增殖率、CCK8法、BrdU法。具體如下：CCK8法：將培養好的GC7901胃癌細胞分為10組，分別加入0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL的PA后，調整細胞數目為2×107個/L，接種至96孔板上，每個濃度6個復孔，在接種后向每孔滴加10 μL配好的CCK8溶液，繼續培養24 h后，用酶標儀檢測各孔的吸光度（OD）值，計算不同劑量PA處理后細胞成活分數，成活分數=處理組OD值/空白對照組OD值;BrdU法：將培養好GC7901胃癌細胞懸浮后，加入生理鹽水調整濃度為5×103/mL接種于96孔板、200 μL/孔，每組3個復孔，預培養12 h，加入0、20、40、80 μg/mL的PA處理48 h后，棄培養液，加入10 μmol/L BrdU繼續孵育24 h，棄培養液，4%多聚甲醛孵育30 min，100 μL過氧化物酶孵育耦合抗BrdU抗體1 h，PBS清洗3次，加入四甲基聯苯胺染色30 min，于熒光顯微鏡下觀察各組細胞陽性數目。

1.2.3.2PA對GC7901胃癌細胞凋亡影響的檢測細胞凋亡率，流式細胞術。具體操作如下：將培養好的GC7901胃癌細胞調整為4×104個/mL，接種于6孔板中、400 μL/孔，每組3個復孔，加入0、20、40、80 μg/mL的PA處理，培養48 h后收集各組細胞，166.5×g離心5 min，PBS洗滌2遍，棄上清液，加入Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒中的緩沖液，混勻，再加入5 μL AnnexinV/FITC、10 μL PI混合，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀上樣檢測，后采用CellQuest軟件分析計算細胞凋亡率。

1.2.3.3PA對GC7901胃癌細胞膜電位變化影響的檢測紅綠熒光信號比例，JC1法。具體如下：將培養好GC7901胃癌細胞懸浮后，加入生理鹽水調整濃度為2×106/mL，添加到6孔板上，分別加入0、20、40、80 μg/mL的PA處理，培養48 h后，加入1 mL JC1工作液，混合均勻后37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育20 min，并將JC1染色緩沖液按1∶5的比例稀釋，孵育結束后，吸去上清，用稀釋后的JC1緩沖液清洗3次后，加入流式細胞測試緩沖液后上機，以紅綠熒光信號比例表示線粒體膜電位情況。

1.2.3.4PA對GC7901胃癌細胞中P53、P21相對表達量的檢測相對表達量，實時PCR。具體如下：按照總RNA提取試劑盒說明書上操作步驟提取0、20、40、80 μg/mL的PA處理48 h后GC7901中的總RNA，凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用紫外分光光度計檢測RNA質量;反轉錄試劑盒說明書將符合標準的RNA反轉為cDNA。反轉錄體系（10 μL）：2×miRNA反應混合液5 μL，0.1% BSA 1 μL，miRNA PrimeScript RT酶混合物1 μL，總RNA 0.5 μL，去RNA酶去離子水（ddH2O） 2.5 μL。反應條件設置：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min。PCR體系10 μL：SYBR Prmix Ex Tap Ⅱ（2×）5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。詳細操作見試劑盒說明書。PCR參數設置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反應進行40個循環。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個樣孔設置3個復孔。用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.2.3.5PA對GC7901胃癌細胞侵襲率影響的檢測穿膜細胞數，Transwell小室試驗。具體如下：將鋪有Matrigel膠的Transwell小室預熱至37 ℃后，用無血清培養液洗滌細胞3次后重懸細胞，分別加入0、20、40、80 μg/mL的PA后，調整細胞密度至1×105個/mL，在Transwell下室放入1 mL含10%胎牛血清的培養液，上室加入300 μL細胞懸液后培養36 h。取出小室，利用棉簽輕柔地擦去上層未穿膜的細胞和基質膠，用冰甲醛對濾膜進行固定后結晶紫染色。將濾膜剝離后正面朝下固定在載玻片上，在光學顯微鏡下隨機選擇5個高倍鏡（×400）下視野進行細胞計數，以穿膜細胞數表示細胞侵襲能力。

1.2.3.6PA對GC7901胃癌細胞中凋亡及侵襲相關蛋白表達量的檢測蛋白相對表達量，Western blotting法。具體如下：提取0、20、40、80 μg/mL的PA處理48 h后GC7901胃癌細胞中總蛋白，利用BCA法進行蛋白定量，并利用Bradford調整各組蛋白濃度一致，經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉膜至甲醛處理過預處理過的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，密封2 h，加入兔抗人Bcl2、Bax、CleavedCaspase3、Caspase3、cMyc、VEGF、波形蛋白、GAPDH一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，PBST漂洗40 min，加入HRP標記的二抗（1∶500）孵育1 h，PBST漂洗40 min，ECL發光液將PVDF膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Image J軟件分析各組條帶灰度值。

1.3統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，假設檢驗的標尺以α=0.05加以比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1PA對SGC7901胃癌細胞增殖活性的影響隨著PA處理濃度的升高，SGC7901胃癌細胞的增殖活性也隨之降低，當處理濃度為40 μg/mL時，增殖活性的降低差異有統計學意義（P<0.05），因此后續試驗選擇20、40、80 μg/mL作為處理濃度。見圖1。

2.2PA對SGC7901胃癌細胞凋亡的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預時SGC7901胃癌細胞的凋亡率差異無統計學意義（P>0.05），40、80 μg/mL PA處理后SGC7901細胞的凋亡率顯著升高（P<0.05）。見圖2。

2.3PA對SGC7901胃癌細胞線粒體膜電位的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預時SGC7901胃癌細胞中JC1紅綠信號比率差異無統計學意義（P>0.05），40、80 μg/mL PA處理后SGC7901胃癌細胞中JC1紅綠信號比率明顯降低（P<0.05）。見圖3。

2.4PA對SGC7901胃癌細胞惡性增殖的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預時SGC7901胃癌細胞內BrdU染色陽性率差異無統計學意義（P>0.05），40、80 μg/mL PA處理后SGC7901胃癌細胞內BrdU染色陽性率明顯降低（P<0.05）。見圖4。

2.5PA對SGC7901胃癌細胞中凋亡相關蛋白表達的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預時SGC7901胃癌細胞中Bax/Bcl2比值明顯升高（P<0.05），cMyc表達水平明顯降低（P<0.05），

ClaevedCaspase3/Caspase3比值差異無統計學意義（P>0.05）;40、80 μg/mL PA處理后SGC7901胃癌細胞中Bax/Bcl2、ClaevedCaspase3/Caspase3比值明顯升高（P<0.05），cMyc表達水平明顯降低（P<0.05）。見圖5。

2.6PA對SGC7901胃癌細胞中P53、P21相對表達水平的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預時SGC7901胃癌細胞內P53、P21相對表達水平差異無統計學意義（P>0.05），40、80 μg/mL PA處理后SGC7901胃癌細胞內P53、P21相對表達水平明顯升高（P<0.05）。見圖6。

2.7PA對SGC7901胃癌細胞侵襲能力及相關蛋白表達的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預時SGC7901胃癌細胞內侵襲細胞數、VEGF、波形蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05），40、80 μg/mL PA處理后SGC7901胃癌細胞內侵襲細胞數、VEGF、波形蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。見圖7。

3討論

雞屎藤作為我國傳統草藥在歷代本草著作中均有記載，主治風濕痹病、脘腹疼痛等，且目前已有全草的提取制劑用于臨床[7]。隨著近年來國內外對雞屎藤化學組分和藥理活性研究的不斷深入，其抗炎、鎮痛、抑菌、影響胃腸道功能以及抗腫瘤等生物活性被不斷發現，并且有研究通過連續給小鼠注射雞矢藤注射液后未見小鼠活動及臟器的異常，可見其安全性較高、毒性小[8]。PA作為一類從雞屎藤中提取主要的環烯醚萜苷類成分，目前尚未有其抗腫瘤活性的相關報道。本研究結果顯示，隨著PA處理濃度的升高，其對SGC7901胃癌細胞系增殖活性的抑制逐漸增強，并且在40 μg/mL時差異有統計學意義，提示PA具有抑制腫瘤增殖的作用，并呈濃度依賴。同時李紅霞等[6]研究證實雞屎藤環烯醚萜苷提取物在500 μg/mL劑量及之下時對細胞無毒性作用，進一步證實了PA具有獨特的抗腫瘤作用。為了進一步研究PA抗腫瘤的可能機制，本研究選擇20、40、80 μg/mL為實驗濃度。

細胞凋亡作為維持機體穩態的重要調控方式，誘導腫瘤細胞凋亡是多種抗癌藥物靶向的關鍵機制[9]。本研究通過流式細胞術發現，隨著PA處理濃度的提高，SGC7901胃癌細胞的細胞凋亡率明顯升高，并且JC1的紅綠信號比率明顯降低。JC1作為檢測線粒體膜電位的理想熒光探針，當線粒體膜電位較高時，其聚集在線粒體基質中，形成聚合物產生紅色熒光，而線粒體膜電位降低時，JC1以單體形式存在，發出綠色熒光，因此綠色熒光的增多提示線粒體膜電位下降，而這一現象是細胞凋亡早期的標志性事件[10]。Bcl2和Bax蛋白是Bcl2蛋白家族的主要蛋白，由于該家族蛋白的主要位點分布在線粒體膜上，因此主要調控線粒體凋亡途徑[11]。Bcl2和Bax蛋白作為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。大多數惡性腫瘤中，Bcl2的表達升高，而Bax的表達降低[12]，但PA處理后，SGC7901胃癌細胞中Bax/Bcl2比值明顯升高，提示PA可能通過下調抗凋亡蛋白，上調促凋亡蛋白表達從而誘導細胞凋亡。Caspases3是Caspases家族誘導細胞凋亡中最關鍵的效應蛋白，在整個細胞凋亡通路中最終都是由Caspases3來行使凋亡功能，因此Caspases3水平與細胞凋亡關系密切[13]。cMyc作為一類與腫瘤細胞無限增殖和增殖后結局密切相關的蛋白，與腫瘤的惡性程度顯著相關[14]。本研究結果顯示，隨PA處理濃度的升高，SGC7901胃癌細胞中具有活性的Caspases3表達水平明顯升高，而cMyc蛋白表達水平明顯降低，表明PA能夠調節細胞增殖促進細胞凋亡。BrdU熒光染色結果顯示，隨PA處理濃度的升高，BrdU染色陽性率明顯降低，也進一步證實了PA對SGC7901胃癌細胞惡性增殖能力的抑制效果。P53基因是體內非常重要的抑癌基因，能夠介導多種信號轉導途徑[15]，使細胞分化停留在G1檢驗點，誘導細胞凋亡，避免細胞到下一代時發生DNA突變，而發生癌變[16];P21則是細胞周蛋白依賴性激酶抑制因子家族中的重要成員，其編碼的蛋白富含精氨酸，能夠抑制細胞周蛋白依賴性激酶和增殖細胞核抗原的表達，而參與細胞DNA損傷修復[17]。本研究中PA處理后，SGC7901胃癌細胞中P53、P21的相對表達水平均明顯升高，提示PA可能是通過調控細胞周期的過程，來抑制癌細胞的惡性增殖。

侵襲、轉移作為惡性腫瘤的重要生物學特征。本研究通過Transwell試驗發現，隨著PA處理濃度的升高，SGC7901胃癌細胞穿膜細胞數明顯降低，提示PA處理抑制了SGC7901胃癌細胞的侵襲能力。惡性腫瘤的生長和轉移依賴于血管的生成，VEGF作為一種血管生長因子，能夠促進腫瘤血管內皮細胞的生長[18]，還能增加血管的通透性，導致周圍組織的纖維蛋白沉積，有利于腫瘤基質的形成及對新生血管的浸潤，從而增強腫瘤的轉移能力[19]。波形蛋白是一種中間絲蛋白，在體內發揮著連接細胞膜和核膜的作用，在間葉組織細胞中表達，是上皮間質轉化的重要因子，在大多數腫瘤細胞中尤其是低分化癌中表達量顯著升高，是判斷腫瘤細胞是否轉移的重要指標之一[20]。本研究發現，PA處理后，SGC7901胃癌細胞中VEGF、波形蛋白的表達水平均明顯降低，表明PA可能通過抑制VEGF、波形蛋白表達進而抑制了SGC7901胃癌細胞的侵襲能力。

綜上所述，PA作為中藥雞屎藤的主要活性成分之一，能夠誘導線粒體膜電位降低，從而激活線粒體凋亡途徑相關蛋白表達，進而誘導細胞凋亡;同時還能夠上調促進抗癌基因表達抑或終止細胞周期而抑制癌細胞的惡性增殖，并且還能夠抑制侵襲相關蛋白的表達，而降低侵襲能力。但本研究只是初步探索了PA調控胃癌細胞的增殖作用，其具體的調控機制以及是否在體內依然有效還有待進一步研究。

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（2020-09-01收稿本文編輯：楊燕）文獻研究

基金項目：遼寧省自然科學基金計劃項目（2017020388）

作者簡介：郭強（1981.02—），男，碩士，副主任醫師，研究方向：胃腸腫瘤，肝膽胰腺腫，Email：guoqiang198102@163.com