馬鈴薯StWRKY轉錄因子的克隆和生物信息學分析

劉子剛，田佩耕，王 寧，翟鑫娜，張云帥，劉毅強，武佳穎，田再民，魏 東,2

(1.河北北方學院，河北 張家口 075000；2.河北北方學院河北省農產品食品質量安全分析檢測重點實驗室，河北 張家口 075000)

【研究意義】馬鈴薯是全球第四大重要的糧食作物，馬鈴薯的生產受到多種環境脅迫的影響，如極端溫度、水澇及高鹽脅迫是影響植株生長發育的重要因素。隨著分子生物學的發展，植物抗逆機理的研究逐漸步進入分子水平。轉錄因子(Transcription factor)又稱反式作用因子，是一種DNA結合蛋白，它可以與基因5′端上游特定序列特異性結合[1]。它對目的基因的轉錄起著增強和阻遏的作用[2]，因此對轉錄因子的研究是從分子層次上認識植物抗逆機制的基礎。WRKY轉錄因子是高等植物中最大的轉錄因子家族之一，在植物響應非生物病害及非生物脅迫的調控途徑中發揮著重要的作用[3]。【前人研究進展】WRKY蛋白結構基本含有1～2個WRKY結構域，該結構域約由60個高度保守的氨基酸殘基組成，包括位于N端的WRKYGQK七肽序列和位于C端的鋅指結構。因其位于N末端的WRKYGQK保守核心序列而得名，位于C端的序列由 C2H2或 C2HC 型鋅指結構組成[4]。研究發現，WRKY基因在植物體內受許多脅迫因子誘導表達，且具有組織特異性[5-6]。WRKY轉錄因子能夠結合目的基因W-box的WRKY結構域，W-box主要位于植物抗逆、損傷和衰老相關基因的啟動子區[7-8]，因此WRKY轉錄因子能夠參與植物體內生物與非生物脅迫應答機制。經NaCl脅迫處理及qRT-PCR 顯示，擬南芥根中有18個AtWRKY基因誘導表達[9]，轉錄組分析表明水稻中的41個OsWRKY基因、擬南芥中的20個AtWRKY基因和油菜中的74個BnWRKY基因參與植物非生物脅迫應答機制，但其誘導表達模式存在差異，說明這些WRKY轉錄因子在各種逆境脅迫應答機制中發揮不同的生物學功能[10-11]。【本研究切入點】目前對WRKY轉錄因子的研究在多個模式植物中較多，但在馬鈴薯WRKY轉錄因子在非生物脅迫中的作用及下游蛋白的調控等方面研究較少。【擬解決的關鍵問題】本文從馬鈴薯中克隆獲得StWRKY基因，對其進行生物信息學分析，并利用PCR分析在不同組織中的表達，進一步通過鹽脅迫和干旱脅迫試驗初步鑒定了StWRKY基因的功能，本試驗初步闡明了StWRKY基因在脅迫應答中的作用，該研究對進一步認識馬鈴薯WRKY轉錄因子有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冀張薯12號馬鈴薯組培苗。

1.2 試驗方法

總RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成: 取幼嫩的組培苗葉片0.5 g，采用黃國文等[12]的方法提取總RNA。以馬鈴薯總RNA為模版，參考諾唯贊cDNA第一鏈的合成說明書，加入3 μL的反轉錄酶，3 μL模板RNA (終濃度1500 ng)，7 μL RT reaction buffer，加ddH2O定容至20 μL。然后進行離心后，于PCR儀中42 ℃，15 min。

馬鈴薯StWRKY和StWRKY6基因PCR擴增程序: ①馬鈴薯WRKY基因的引物設計。利用Primer 5.0軟件設計引物。StWRKY-F的引物序列(5′-3′)為CTCTCCACTTTTACATTCTCAG；StWRKY-R的引物序列(5′-3′)為GCCTTACTAGGCATTGAAAG。②馬鈴薯WRKY基因PCR擴增程序。擴增總體積為50 μL，其中2×Vazyme Lamp Master Mix 25 μL，模板DNA 1 μL，StWRKY-F(10 μmol/L) 2 μL，StWRKY-R (10 μmol/L) 2 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴增程序為94 ℃下預變性5 min;然后進入循環，94 ℃變性30 s，在50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，持續35個循環后;將其在72 ℃下延伸7 min，最后4 ℃保存。

馬鈴薯WRKY基因擴增產物的檢測：利用1%瓊脂糖凝膠電泳的方法進行檢測。

生物信息學分析：使用NCBI完成WRKY基因的ORF查找和氨基酸序列的分析；用ProtParam工具完成蛋白分子量和理論等電點的分析；用DNAMAN軟件進行蛋白同源性比對并構建系統進化樹；用Expasy工具完成蛋白疏水性分析；使用TMHMM Server完成蛋白質跨膜結構域預測；使用SOPMA構建蛋白質二級結構；用Expasy工具構建蛋白質三級結構。

實時定量PCR：利用 Primer Premier 5.0 設計的熒光定量上游引物和下游引物，引物序列如下：StWRKY-F：5′-CTAATGGCAAGCATGGAAACTCCAA-3′，StWRKY-R ：5′-CTTGGCTCCTTGTTTGGAAAGCATA-3′；用反轉錄得到cDNA 稀釋10倍作為熒光定量模板，內參基因為Actin，引物序列如下：Actin-F：5′-CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT-3′，Actin-R：5′-CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG-3′。參照Trans Start Top Green qPCR Super Mix (Transgen)說明進行RT-qPCR分析。采用 2-ΔΔCT方法分析基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 StWRKY基因的克隆和編碼氨基酸序列分析

以馬鈴薯cDNA為模板進行PCR擴增，電泳結果顯示在747 bp處有目標條帶(圖1)。該基因共編碼了248個氨基酸(圖2)。

圖1 StWRKY基因PCR擴增產物Fig.1 PCR amplification product of StWRKY gene

圖2 StWRKY基因cDNA序列及編碼氨基酸序列Fig.2 StWRKY gene cDNA sequences and coding amino acid sequences

2.2 StWRKY蛋白序列比對和進化樹的構建

在NCBI中利用BLAST查找其他物種WRKY基因編碼的同源蛋白序列進行比對，馬鈴薯WRKY基因與潘那利番茄(Solanumpennellii)(XP015075730.1)同源性最高達到了97.1%；中華辣椒(Capsicumchinense)(PHU02980.1)同源性達到了79.1%；毛酸漿(Physalispubescens)(AZB50357.1)同源性達到了79.1%；與風鈴辣椒(Capsicumccatum)(PHT34361.1)、茸毛煙草(Nicotianatomentosiformis)(XP009615508.1)、紅梅(Prunusmume)(XP008222197.1)的同源性分別達到了82.4%、67.2%、62.2%。通過DNAMAN構建系統進化樹，如圖3所示。該進化樹被分為2組(GroupsⅠ和GroupsⅡ)，GroupsⅠ有7個WRKY蛋白(StWRKY、SlWRKY、SpWRKY、NtWRKY、PpWRKY、CbWRKY、CcWRKY)，GroupsⅡ有一個WRKY蛋白(PmWRKY)，StWRKY蛋白和GroupsⅠ中的SlWRKY蛋白相似度最高達到97.1%，且與同屬茄科的SlWRKY、SpWRKY處于同一分支；反之與煙草，辣椒的系統發育距離較遠[13]。通過DNAMAN構建系統進化樹，其中馬鈴薯WRKY基因與番茄WRKY基因在同一支上，親緣關系最近，其次是煙草、毛酸漿、辣椒，為茄科植物在一個大分支內；紅梅在另一個分支內。馬鈴薯WRKY基因與番茄WRKY基因在同一支上，親緣關系較近。

圖3 StWRKY的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of StWRKY

2.3 StWRKY的蛋白分子量和理論等電點分析

通過ProtParam軟件(網址:http://www.expasy.org/tools/protparam.html)在線預測并分析StWRKY蛋白質的性質，分析結果表明StWRKY蛋白共有172個氨基酸，分子量19 921.58，理論等電點9.22，帶負電殘基總數21，帶正電殘基總數28，不穩定系數40.56，為不穩定蛋白。

2.4 StWRKY的蛋白親水性和疏水性分析

利用Expasy工具(http://au.expasy.ch/tools/protscale.html)中的ProtScale軟件在線分析氨基酸的親水以及疏水性。StWRKY蛋白質的親水性分析，由圖4可知，StWRKY平均親水系數為-0.836，為親水性蛋白。

圖4 StWRKY蛋白的親水性分析Fig.4 Hydrophilicity analysis of StWRKY protein

2.5 StWRKY蛋白質二級結構和三級結構預測

通過SOPMA(網址：http:pbil.ibcp.fr/)進行蛋白質二級結構的預測。如圖5所示，StWRKY蛋白質二級結構以無規曲線(69個)為主，占40%；其次為α-螺旋(64個)，占37.3%；伸展鏈(26個)，占15.1%；β-折疊(13個)，僅占7. 6%。

通過在線網址(http://www.expasy.org/)進行蛋白質三級結構的預測，獲得StWRKY蛋白質三級結構圖，從圖6可以看出，具有5個折疊一個螺旋。

圖5 StWRKY蛋白的二級結構預測Fig.5 Secondary structure prediction of StWRKY protein

圖6 StWRKY蛋白的三級結構預測Fig.6 Prediction of tertiary structure of StWRKY protein

2.6 StWRKY蛋白序列跨膜區預測

通過TMHMM工具(在線網址:www.cbs.dtu.dk/services/)進行蛋白序列跨膜區預測圖，由圖7顯示，StWRKY蛋白的紫色線的概率趨近于1，屬于非跨膜蛋白。

圖7 StWRKY蛋白質跨膜結構預測Fig.7 Prediction of WRKY protein transmembrane structure in potato

2.7 StWRKY在不同組織部位的表達模式分析

利用實時熒光定量PCR技術分析StWRKY基因分別在根、莖、葉中的表達情況。由圖8可知，該基因的表達量由高到低依次是葉、根、莖。

圖8 StWRKY基因在不同組織部位的表達模式Fig.8 Expression pattern of StWRKY in different parts

2.8 StWRKY在脅迫下的表達分析

利用RT-qPCR分析StWRKY低溫能誘導的表達情況。由圖9可知，處理4 h后，StWRKY相對表達量明顯增加，約為對照的2.5倍，在處理6、8 h后，相對表達量沒有明顯變化，說明StWRKY在低溫誘導的早期響應這一生理過程。

圖9 低溫脅迫下StWRKY基因表達分析Fig.9 Expression analysis of StWRKY gene under low temperature stress conditions

圖10 鹽脅迫下StWRKY基因表達分析Fig.10 Expression analysis of StWRKY gene under salt stress conditions

利用RT-qPCR分析StWRKY在鹽脅迫的誘導下的表達情況。由圖10可知，處理3 h后StWRKY的相對表達量急劇上升，約為對照的6倍，處理7 h后，相對表達量到達高峰，在處理5、7、9 h后，相對表達量沒有明顯變化，說明StWRKY在鹽誘導的早期響應這一生理過程。

3 討 論

WRKY轉錄因子家族是廣泛存在于植物中的一類重要蛋白，其可以在很多逆境脅迫中發揮作用減少逆境對植物帶來的傷害，因此對WRKY家族的研究至關重要。本試驗對馬鈴薯StWRKY進行了生物信息學分析。StWRKY蛋白質的二級結構以無規曲線為主，StWRKY蛋白質的二級結構預測比例為無規則卷曲>α-螺旋>伸展鏈>β-折疊，與番茄SpWRKY1、SpWRKY2、SpWRKY3的二級結構的比例遵循相似[14]。StWRKY基因的平均親水系數為-0.836，為親水蛋白，親水蛋白中含有大量親水氨基酸，而過表達一些親水蛋白可以增強植株耐受干旱、低溫、高鹽等不利環境影響的能力[15]。

利用RT-qPCR分析發現，馬鈴薯StWRKY在低溫處理4 h后表達量顯著增加，且在處理6 h后表達量達到峰值，番茄WRKY基因在低溫處理2 h后表達量達到峰值，與馬鈴薯兩類WRKY基因的表達量均為先升后降[16]，煙草NtWRKY8在低溫處理6 h后表達量達到峰值，這說明WRKY基因在低溫誘導的早期響應這一過程[17]，也有研究表明WRKY基因在低溫誘導時表達量呈現升—降—升的規律[18]。利用RT-qPCR分析發現，StWRKY在鹽脅迫處理3 h后表達量顯著增加，玉米ZmWRKY53基因在鹽脅迫處理12h表達量達到峰值，與馬鈴薯StWRKY基因的表達量為先升后降，這與上述面對低溫溫脅迫時表達量變化較為一致[18]。通過同源蛋白比對并構建系統進化樹(圖3)，發現馬鈴薯StWRKY基因與茄科作物中的番茄同源性最高，番茄SlWRKY23通過上調SlRD22和SlDREB2A的表達量提高番茄耐鹽性[19]，番茄轉入SlWRKY53基因的植株對鹽脅迫的抗性明顯強于野生型[20]，研究表明番茄WRKY基因具有抵抗非生物脅迫的能力，能對低溫、干旱、高鹽脅迫具有耐受性[21]。

實時熒光定量PCR結果表明，馬鈴薯StWRKY在葉和根中的表達相對較高，番茄SlWRKY23在變色期果實中的表達最高，在莖中的表達較低，根和葉比莖中的表達分別高5和7倍，這與馬鈴薯StWRKY基因的表達較為一致[19]，大豆GmWRKY28-like在根、種子中表達量較低，在葉、花和莖尖分生組織表達量較高[22]，玉米ZmWRKY53在根、葉中表達量較高[18]，番茄SlWRKY53在成熟莖中的表達最高，在幼莖和幼根中的表達相對較少[20]。WRKY基因在植株不同器官間表達差異與其生物學功能有關，馬鈴薯StWRKY轉錄因子在葉中的表達較高可能與其通過調控脫落酸參與植物非生物脅迫應答有關，脫落酸是一種植物激素，可以調節植物面對非生物脅迫時的反應，研究發現脫落酸受體ABAR位于細胞質的C端能夠和數個WRKY轉錄因子發生相互作用[23]，擬南芥WRKY31受脫落酸誘導表達[24]，過表達擬南芥OsWRKY45的突變體植株經水分脅迫后能夠關閉更多氣孔，降低植株體內水分減少的速度，使水分能夠維持更好地平衡[25]，WRKY57通過提高ABA水平增加擬南芥的耐旱性[26]，另一方面也有可能通過改善適應性氧化物來提高植株的抗逆性[27]。

4 結 論

馬鈴薯StWRKY基因受低溫脅迫和鹽脅迫誘導表達，番茄WRKY44和WRKY1基因在鹽脅迫方面起重要作用[28]，SpWRKY6轉錄因子有提高抗煙草疫霉的功能[29]，綜上所述，初步證明StWRKY基因在馬鈴薯面對各種逆境脅迫時可以發揮重要作用，為了更好地揭示StWRKY轉錄因子的具體功能，未來還需進一步研究。