內標法測定動物肉中脂肪酸組成及含量

張春華　寶　華　張崇志　李勝利　特日格勒　金　鹿　薩初拉　王海明　畢力格巴圖　孫海洲

內標法測定動物肉中脂肪酸組成及含量

張春華寶華張崇志李勝利特日格勒金鹿薩初拉王海明畢力格巴圖孫海洲

（內蒙古自治區農牧業科學院內蒙古呼和浩特010031）

試驗通過GC2030氣相色譜儀，利用100 m長的SP-2560毛細管色譜柱，采用內標法定量定性分析山羊肉中脂肪酸組成及含量。結果顯示，此方法簡便、快捷，加入的內標C11與待測樣品組分中的C11相似或相近時間出峰，線性范圍好，相關系數達0.999 0以上，回收率為84.33%～91.66%，相對標準偏差（RSD）在5%左右。

內標法；氣相色譜法；肉樣脂肪酸；組成；含量

內蒙古是我國重要的畜牧業生產基地，盛產牛羊肉。隨著生活水平的不斷提高和膳食結構的改善，人們對肉質鮮嫩適口，富含人體所需蛋白質、不飽和脂肪酸和氨基酸的優質肉品需求越來越高。因此，研究者越來越關注畜產品的品質。本試驗通過對山羊肉樣品進行水解、脂肪提取、脂肪皂化和甲酯化，最后上機測定肉中脂肪酸組成及含量，為進一步研究肉、乳脂肪酸含量的測定提供有效方法和理論數據[1-2]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗儀器：島津氣相色譜儀（型號：GC2030）、FID檢測器、全自動進樣器、100 m×0.25 μm×0.2 nm的SP2560毛細管柱（賽默飛世爾公司提供）。

試驗試劑：高純氮氣（N2，純度99.99%）、37種脂肪酸混標（SIGMA公司提供）、水（符合GB/T 6682中規定的一級水）、無水乙醇色譜試劑、無水乙醚色譜試劑、鹽酸、CH3OH（色譜純）、正庚烷（色譜純）、三氟化硼甲醇（色譜純）、NaOH（分析純）、NaCl、無水Na2SO4、C11內標（SIGMA公司提供）。

1.2 儀器條件

氣相色譜儀采取程序升溫法進行設置，初始溫度100 ℃，保持5 min，以3 ℃/min的速度升溫到240 ℃，保持35 min；進樣口溫度240 ℃，檢測器溫度240 ℃；載氣為高純N2；分流比值20∶1；每次自動進樣1 μm。

1.3 樣品的前處理

1.3.1 樣品稱取與水解

使用感量0.1 mg的天平稱取山羊肉樣品2 g或2 g以內放入平底燒瓶中，加入備好的內標2 mL，再加2 mL95%的乙醇，繼續加配制濃度為8.3 mol/L的鹽酸10 mL，混勻。將平底燒瓶放入85 ℃水浴鍋內水浴40 min，其間振蕩幾次，之后室溫冷卻備用。

1.3.2 脂肪的提取

向水解好的備樣中加入10 mL95%的乙醇，混勻。將平底燒瓶中的水解液全部轉移到250 mL的分液漏斗中，再將100 mL乙醚和石油醚1∶1的混合液分3次倒入分液漏斗中，加蓋，繼續搖晃數次混勻。靜置分層30 min后，棄去分液漏斗下層溶液，上層醚層經塞含無水Na2SO4棉花的大漏斗過濾后，轉移至250 mL平底燒瓶中，再用30 mL乙醚和石油醚1∶1的混合液沖洗分液漏斗，再轉移至平底燒瓶中。用旋轉蒸發儀濃縮至干，平底燒瓶中剩下的殘留物為脂肪提取物。

1.3.3 脂肪的皂化和甲酯化

向上步提取物中加入10 mL濃度為2%的氫氧化鈉甲醇溶液，放入回流冷凝裝置的水浴鍋中，90 ℃水浴回流30 min。冷凝回流大概25 min時，從冷凝管上端加入7 mL三氟化硼甲醇溶液，再加2 mL甲醇，繼續回流幾分鐘后取下回收瓶冷卻。再加10 mL正庚烷，手搖振蕩3 min～5 min，加飽和NaCl至瓶頸，放入超聲儀中超聲10 min后取出靜放，等待分層。分層后，用裝有無水Na2SO4的一次性注射器吸取上層正庚烷層液體1 mL左右，用濾膜將溶液過濾后放入樣瓶中備用。

1.3.4 脂肪酸混標的配置

將37種脂肪酸標準品混標配制成4個不同濃度待測，分別為0.15 mg/mL、0.35 mg/mL、0.6 mg/mL和0.8 mg/mL。

1.3.5 試樣中脂肪酸含量的計算

參照國家標準GB 5413.27—2010《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定》[3]，計算試樣中的脂肪酸含量。

1.4 樣品的回收率測定

已知含量的待測樣中加入已配好的不同濃度的標準品溶液，繼續上機檢測，再計算回收率。回收率=（待測混合樣測定值/原樣濃度+標準品加入量）×100%。

2 結果與討論

2.1 脂肪酸標準品譜圖

將配制好的不同濃度的37種脂肪酸標準品混標上機后，根據每種脂肪酸甲酯氣相色譜圖的峰面積，以標準品色譜圖出峰的保留時間為依據，對未知樣品中測定出的脂肪酸進行定性，以碳十一烷酸（C11:0）內標峰面積定量分析未知樣品中脂肪酸的相對含量。脂肪酸標準品的氣相色譜圖如圖1。

2.2 標準曲線的制作

以配制好的37種脂肪酸標準品的不同濃度為軸，峰面積為軸，制作37條標準曲線，進行回歸計算。圖2為其中短鏈C4:0和長鏈C22:6n3的標準曲線圖，回歸方程分別為：=3E-06-0.005 9，2=0.999 5；=9E-07+0.001 1，2=0.999 3。

圖2　脂肪酸標準品標準曲線圖

2.3 回收率的測定

樣品的回收率測定值如表1，從表1中數據可見，樣品的回收率測定值均在84%以上。

表1樣品的回收率測定值

組分原樣濃度標準品加入量/mg/mL混合樣實測值/mg/mL回收率/%`x±RSD%123123123 C11:00.010 10.008 00.004 00.002 00.017 00.012 70.010 293.7490.1584.1989.73±5.40 C12:00.020 60.016 00.008 00.004 00.034 40.026 10.020 993.9091.1785.0790.05±5.02 C13:00.010 40.008 00.004 00.002 00.017 40.013 40.010 794.7992.7986.6291.40±4.66 C14:00.021 10.016 00.008 00.004 00.035 10.026 60.022 394.6391.5088.8691.66±3.15 C14:10.010 10.008 00.004 00.002 00.016 70.013 00.010 492.2291.8585.9590.01±3.95 C15:00.010 60.008 00.004 00.002 00.017 50.013 50.010 994.2692.5186.3191.03±4.59 C15:10.010 40.008 00.004 00.002 00.017 60.013 40.010 795.6192.8685.9291.46±5.46 C16:00.027 40.016 00.008 00.004 00.038 90.031 10.026 089.5987.9582.8686.80±4.03 C16:10.010 00.008 00.004 00.002 00.016 90.012 90.010 393.9091.8185.9990.57±4.53 C17:00.009 50.008 00.004 00.002 00.015 70.011 80.009 689.8687.6783.3586.96±3.81

續表1樣品的回收率測定值

組分原樣濃度標準品加入量/mg/mL混合樣實測值/mg/mL回收率/%`x±RSD%123123123 C18:00.018 10.016 00.008 00.004 00.030 80.023 20.018 590.2788.9583.5787.60±4.05 C18:1n9c0.018 20.016 00.008 00.004 00.031 00.023 10.018 690.7487.9883.7887.50±4.01 C18:2n6t0.010 50.008 00.004 00.002 00.017 50.013 30.010 694.7591.5584.8490.38±5.60 C18:2n6c0.009 30.008 00.004 00.002 00.015 60.011 50.009 590.1286.7583.9586.94±3.55 C20:00.018 70.016 00.008 00.004 00.031 70.023 80.019 091.4589.2483.7888.16±4.48 C18:3n60.009 50.008 00.004 00.002 00.015 80.011 90.009 690.5287.8783.2687.22±4.21 C20:10.009 40.008 00.004 00.002 00.015 80.011 90.009 690.9688.9383.9187.93±4.13 C21:00.010 00.008 00.004 00.002 00.016 30.012 40.010 090.4988.9182.9587.45±4.55 C20:20.009 60.008 00.004 00.002 00.015 80.012 00.009 789.8688.1883.2687.10±3.94 C22:00.018 80.016 00.008 00.004 00.031 50.023 60.019 190.5687.9483.7587.42±3.93 C22:1n90.009 40.008 00.004 00.002 00.015 60.011 80.009 589.8088.3983.5087.23±3.79 C20:3n60.009 00.008 00.004 00.002 00.015 10.011 30.009 088.5987.1881.9285.90±4.09 C22:20.009 40.008 00.004 00.002 00.015 70.011 60.009 589.9686.3983.3986.58±3.80 C24:00.018 70.016 00.008 00.004 00.031 60.023 80.019 191.0789.1584.2288.15±4.01 C20:5n30.010 00.008 00.004 00.002 00.016 90.012 80.010 393.8091.1185.5690.16±4.66 C24:10.009 60.008 00.004 00.002 00.016 00.012 00.009 690.9387.8983.0287.28±4.57 C22:6n30.010 00.008 00.004 00.002 00.016 30.012 50.010 290.7589.1484.6088.16±3.62

2.4 山羊肉中脂肪酸組成及含量

肉樣脂肪酸組成及含量測定結果如表2。由表2可見，肉樣中股二頭肌、背最長肌、臂三頭肌不同部位的脂肪酸含量差異不顯著（>0.05）。總不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸（U/S）的比值范圍為1.35～1.50，多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸（P/S）的比值范圍為0.20～0.28，這與陳雪軍等（2008）研究的月齡對湖羊脂肪酸的影響[4]結果一致。

表2肉樣脂肪酸組成及含量測定結果

脂肪酸肉樣 化學名分子式臂三頭肌背最長肌股二頭肌 十二碳酸C12:00.150.130.14 十四碳酸C14:01.231.671.33 順-9-十四碳一烯酸C14:10.120.140.12 十五碳酸C15:00.350.470.28 順-10-十五碳一烯酸C15:10.670.580.78 十六碳酸C16:020.1921.3719.95 順-9-十六碳一烯酸C16:11.651.971.75 十七碳酸C17:00.901.181.11 十七碳一烯酸C17:10.821.050.97 十八碳酸C18:015.5516.1816.37 反-9-十八碳一烯酸C18:1n9t1.251.751.32 順-9-十八碳一烯酸C18:1n9c47.0142.6442.58 反,反-9,12-十八碳二烯酸C18:2n6t0.100.060.08 順,順-9,12-十八碳二烯酸C18:2n6c3.474.145.56 順,順,順-9,12,15-十八碳三烯酸C18:3n60.130.130.16 順,順,順-6,9,12-十八碳三烯酸C18:3n31.181.471.76 二十碳酸C20:00.380.080.19 順-11-二十碳一烯酸C20:10.150.120.14 順,順-11,14-二十碳二烯酸C20:20.130.070.09

續表2肉樣脂肪酸組成及含量測定結果

脂肪酸肉樣 化學名分子式臂三頭肌背最長肌股二頭肌 順,順,順-8,11,14-二十碳三烯酸C20:3n60.230.240.33 順,順,順-11,14,17-二十碳三烯酸C20:3n30.170.150.24 順,順,順,順-5,8,11,14-二十碳四烯酸C20:4n61.171.281.37 全順-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸C20:5n30.920.971.44 二十一碳酸C21:00.490.680.06 二十二碳酸C22:00.630.760.98 順-13-二十二碳一烯酸C22:1n90.160.160.08 順,順-13,16-二十二碳二烯酸C22:20.090.070.08 全順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸C22:6n30.370.380.48 二十四碳酸C24:00.090.070.25 二十四碳一烯酸C24:10.090.040.09 單不飽和脂肪酸MUFA（%） 52.1648.4547.83 多不飽和脂肪酸PUFA（%） 8.128.9611.51 不飽和/飽和U/S（%） 1.501.351.46 多不飽和/飽和P/S（%） 0.200.210.28

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

2000年前后，37種脂肪酸的測定儀器也是氣相色譜儀，但所使用的柱子有填充柱和石英柱[5-6]等。隨著科學的發展和儀器設備的轉型升級，以及氣相色譜技術的迅猛發展，現在主要使用不同長度的毛細管柱來測定脂肪酸組成及含量。因為毛細管柱子長、柱效高，大大彌補了其他柱子分離能力較差的缺點，很容易分離結構復雜的混合物成分，尤其適用于脂肪酸同分異構體的分離。本試驗采用以聚100%二氰丙基硅氧烷為固定相的SP-2560（100 m×0.25 mm×0.2 μm）毛細管色譜柱，每個脂肪酸分離出來的峰較清晰，效果較好。

3.2 內標法和外標法的比較

37種脂肪酸的測定有內標法和外標法兩種。鄭玉梅等（2002）測定奶油中c9，t11-共軛亞油酸含量時，是用十七烷酸甲酯為內標定量分析的[7]。張春華等（2012）采用外標法，利用GC2014氣相色譜儀測定動物肉脂肪酸組成[8]。過去，用外標法測定脂肪酸是用面積歸一化法來進行計算的，系統誤差較大，而內標法的優點是較好地克服了實驗過程中的系統誤差。本研究是以C11為內標，采用內標法測定動物肉中脂肪酸的組成及含量，結果表明，第十碳以上的長鏈脂肪酸分離的線性范圍好，相關系數達0.999 0以上，回收率為84.33%～91.66%，相對標準偏差在5%左右[9]。

4 結語

脂肪酸的甲酯化步驟及使用的藥品有很多種[8]。下一步繼續開展肉、乳脂肪酸測定試驗時，有必要采用張春華等[8]（2012）的研究中提到的脂肪酸前處理中不同的甲酯化步驟做對比，比較測定結果，進一步篩選出脂肪酸甲酯化方法的優劣。

[1]WILLIAMSCM.Dietaryfattyacidsandhumanhealth[J].AnnalesdeZootechnie,2000,49(3):165-180.

[2]李金霞.精氨酸及大豆油對細毛羊骨骼肌蛋白質合成和肌內脂肪含量變化的影響[D].內蒙古農業大學,2011.

[3]中國人民共和國衛生部.食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定:GB 5413.27—2010[S].北京:中國標準出版社,2010.

[4]陳雪君.湖羊肌肉和皮下脂肪組織的脂肪酸組成研究[J].浙江大學學報(農業與生命科學版),2008(6):641-648.

[5]梁靜,張文舉,王博.影響羊肉品質因素的研究進展[J].中國畜牧獸醫,2016,43(5):1250-1254.

[6]張愛平,彭方,余方白,等.不同月齡湖羊及其雜種乳羔肉脂肪酸含量的研究[J].家畜生態學報,2018,39(3):29-33.

[7]鄭玉梅,陳炳卿,楊艷梅,等.氣相色譜分析法測定奶油中c9,t11-共軛亞油酸的含量[J].中華預防醫學雜志,2002(4):49-51.

[8]張春華,孫海洲,趙存發,等.氣相色譜法測定動物肉中脂肪酸組成[J].畜牧與飼料科學,2012,33(7):4-7.

[9]劉夢靜.放牧和舍飼綿羊肉的脂肪酸特征及判別模型研究[D].呼和浩特:內蒙古農業大學,2020.

10.3969/j.issn.2095-1205.2022.02.21

TS251.7

A

2095-1205(2022)02-66-04

2022年內蒙古自治區草食動物營養科學重點實驗室項目（2022CXJJM14）；2020年內蒙古自然基金聯合基金項目（2020LH03019）；2021年內蒙古自治區留學回區人員創新啟動支持計劃項目

張春華（1978- ），女，蒙古族，內蒙古通遼人，博士，副研究員，研究方向為反芻動物營養與飼料科學。

孫海洲（1971- ），男，蒙古族，內蒙古烏海人，博士，研究員、博士生導師，研究方向為反芻動物營養調控理論研究。