乳腺癌組織miR-92a、KLF4 mRNA的表達及與臨床病理參數、預后的關系*

胡學麗，范先成

（長沙市第一醫院乳甲外科，湖南長沙410005）

乳腺癌是女性最常見且病死率最高的惡性腫瘤，2020年全球新發乳腺癌病例226.1 萬，死亡68.5 萬，我國新發乳腺癌病例41.6 萬，死亡11.7 萬，嚴重威脅女性生命健康[1]。近年來乳腺癌的治療取得較大進展，其預后相對肺癌、結直腸癌、肝癌等惡性腫瘤更好，但3%～10%的乳腺癌患者在確診時已經存在轉移，30%早期乳腺癌可進展為晚期乳腺癌，其5年生存率＜20%[2-3]。因此，有必要進一步研究乳腺癌生物學和分子機制，識別乳腺癌新的治療靶點。miRNA 是一種單鏈非編碼內源性RNA 分子，能調控靶基因表達，參與腫瘤的發生、發展[4]。研究報道，miR-92a 在肝細胞癌、胃癌等惡性腫瘤中異常表達，與癌細胞增殖、遷移、侵襲有關[5-6]。細胞周期調控異常、上皮間質轉化、腫瘤干細胞樣特性維持在腫瘤發生、發展中發揮重要作用，KLF4 是一種鋅指結構轉錄因子，其參與調控細胞周期、上皮間質轉化、腫瘤干細胞樣特性等。有研究報道KLF4 參與卵巢癌、胃癌等惡性腫瘤進展[7-8]，且miR-92a、KLF4 mRNA 在乳腺癌組織中表達上調[9-10]。本文探討miR-92a、KLF4在乳腺癌組織中的表達及與臨床病理參數、預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月—2016年9月長沙市第一醫院乳甲外科收治的124 例乳腺癌患者。收集患者癌組織和距癌組織＞5 cm 的癌旁組織。患者年齡32～72 歲，平均（50.54±8.68）歲；腫瘤直徑≥5 cm 有45 例，＜5 cm 有79 例；分化程度：低分化47 例，中高分化77 例；雌激素受體陽性66 例，陰性58 例；孕激素受體陽性74 例，陰性50 例；臨床分期[11]：Ⅰ、Ⅱ期83例，Ⅲ、Ⅳ期41例；有淋巴結轉移44 例，無淋巴結轉移80 例。納入標準：①經術后病理檢查確診為乳腺癌；②初診，未接受任何抗腫瘤治療；③病理資料和隨訪資料完整；④患者及家屬均知情同意。排除標準：①合并其他腫瘤；②年齡＜18 歲；③嚴重心、肝、腎等臟器疾病；④全身感染性疾病。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

從液氮中取出50 mg 癌組織、癌旁組織研磨，使用Trizol 試劑盒提取總RNA，Narodrop 驗證cDNA 濃度及純度，將OD260/OD280 調整為1.8～2.0，TaKaRa 試劑盒轉錄合成cDNA，使用qRT-PCR 試劑盒進行qRT-PCR 擴增。miR-92a 正向引物：5'-GATCTGGAT TGATATCAT-3'，反向引物：5'-TTCGAATGAGGACTA ATA-3'，分別為18 bp 和20 bp；KLF4 正向引物：5'-ATGGCTGGAATACATGCT-3'，反向引物 ：5'-ACTCGTAAGCCTGTGCAG-3'，分別為21 bp 和22 bp；miR-92a內參U6正向引物：5'-TTACTGATTCGCTAGC AT-3'，反向引物：5'-CCGATTCTACGCTCGTGA-3'，分別為21 bp 和25 bp；KLF4 內參GAPDH 正向引物：5'-GAGCCTTGAAGACTTGAT-3'，反向引物 ：5'-CTACGGACGACTCTGAAT-3'，分別為19 bp 和20 bp。反應體系：5.0 μL SYBR Premix Ex Taq，0.2 μL 引物，0.2 μL ROX 參考染料，1.0 μL cDNA 模板，3.4 μL 經DEPC 處理水。反應條件：95℃預變性90 s、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，共40 個循環，采用2-ΔΔCt法計算各組織中miR-92a、KLF4 mRNA 相對表達量。

1.3 隨訪

患者出院后通過門診或電話隨訪5年，截止至2021年9月，隨訪終點為治療后至任何原因導致死亡的時間或隨訪截止的時間。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 26.0 統計軟件，計數資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；相關性分析用Pearson 法；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗；多因素Cox 回歸模型分析患者預后不良的危險因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-92a、KLF4 mRNA相對表達量及其相關性

乳腺癌組織中miR-92a、KLF4 mRNA 相對表達量分別為（1.627±0.436）和（2.270±0.569），癌旁組織分別為（1.007±0.192）和（1.104±0.144），癌組織和癌旁組織中miR-92a、KLF4 mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（t=13.910 和21.227，均P=0.000），癌組織高于癌旁組織。Pearson 相關性分析顯示，乳腺癌組織中miR-92a mRNA 與KLF4 mRNA表達呈正相關（r=0.612，P=0.000）。見圖1。

圖1 相關性散點圖

2.2 不同臨床病理特征乳腺癌患者的miR-92a、KLF4 mRNA相對表達量比較

不同臨床分期、有無淋巴結轉移乳腺癌患者miR-92a、KLF4 mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），臨床分期Ⅲ、Ⅳ期和有淋巴結轉移患者的miR-92a、KLF4 mRNA 表達水平高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ期和無淋巴結轉移患者。不同年齡、腫瘤直徑、分化程度、雌激素受體、孕激素受體患者miR-92a、KLF4 mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征乳腺癌患者的miR-92a、KLF4 mRNA相對表達量比較 （±s）

表1 不同臨床病理特征乳腺癌患者的miR-92a、KLF4 mRNA相對表達量比較 （±s）

臨床病理特征年齡≥50歲＜50歲腫瘤直徑≥5 cm＜5 cm分化程度低分化中、高分化n miR-92a mRNA t 值P 值KLF4 mRNA t 值P 值50 74 1.667±0.379 1.596±0.476 0.858 0.393 2.298±0.568 2.249±0.573 0.454 0.651 45 79 1.696±0.422 1.583±0.441 1.368 0.174 2.332±0.636 2.230±0.521 0.930 0.354 47 77 1.707±0.429 1.571±0.435 1.657 0.100 2.370±0.607 2.200±0.534 1.577 0.118

續表1

2.3 miR-92a、KLF4 mRNA 表達與乳腺癌患者生存率的關系

乳腺癌患者累積生存率為70.97%，以miR-92a、KLF4 mRNA 相對表達量均值（分別為1.627 和2.270）為基準將患者分為高表達、低表達。高miR-92a 表達患者（55 例）和高KLF4 mRNA 表達患者（58例）的累積生存率分別為58.18%（32/55）、60.34%（35/58），低miR-92a 表達患者（69 例）、低KLF4mRNA 表達患者（66 例）分別為81.16%（56/69）、80.30%（53/66），經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=8.833、8.652，均P=0.003），高表達患者低于低表達患者。見圖2。

圖2 高、低miR-92a、KLF4 mRNA表達乳腺癌患者Kaplan-Meier生存曲線

2.4 乳腺癌患者預后不良影響因素的多因素Cox回歸分析

以低分化腫瘤（是=1，否=0）、臨床分期Ⅲ、Ⅳ期（是=1，否=0）、淋巴結轉移（是=1，否=0）、miR-92a（≥1.627= 1，＜1.627=0）和KLF4 mRNA（≥2.270=1，＜2.270= 0）作為自變量，以是否死亡作為因變量（是=1，否=0），進行多因素Cox回歸分析。結果顯示，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期[=3.716（95% CI：1.765，7.826）]、淋巴結轉移[=3.021（95% CI：1.341，6.803）]、miR-92a mRNA 相對表達量≥1.627 [=3.401（95% CI：1.358，8.515）]、KLF4 mRNA 相對表達量≥2.270 [=2.059（95% CI：1.026，4.133）]是乳腺癌患者預后不良的危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 乳腺癌患者預后不良影響因素的多因素Cox回歸分析參數

3 討論

乳腺癌主要由乳腺上皮細胞增殖失控進而惡變形成，是嚴重影響女性身心健康的惡性腫瘤，其發生、發展與多種基因異常表達密切相關，近年來手術、放療、化療、靶向治療、免疫治療等多學科綜合治療策略極大地改善了患者的預后，但晚期乳腺癌仍然難以治愈[3]。同時放療作為降低保乳手術和高危乳房切除患者復發和延長生存期的重要手段，在治療過程中也易出現獲得性抵抗，導致乳腺癌復發或轉移[12]。腫瘤是多基因、多機制共同參與的復雜過程，近年來分子生物學發展為腫瘤治療提供了新的途徑，但乳腺癌在基因水平上的治療仍然缺乏有力證據，有必要進一步探索乳腺癌增殖、轉移、復發相關機制，對完善乳腺癌治療策略和評估乳腺癌患者預后具有重要意義。

miRNA 是一類內源性長約18～25 個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，可在3'-非翻譯區與靶基因的mRNA 結合，導致靶基因轉錄后沉默，從而調控靶基因的表達，在包括乳腺癌在內多種腫瘤中發揮癌基因或抑癌基因功能[4]。如miR-370-5p 能靶向下調LUC7 樣3 前體剪接因子抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲能力[13]。miR-92a 為高度保守的miR-17-92 基因簇一員，位于人染色體13q31.3。近年研究表明其參與多種惡性腫瘤進展，如ZHENG 等[14]報道，miR-92a 在前列腺癌中表達上調，能通過調控第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因/蛋白激酶B 信號通路促進前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。WANG 等[15]研究報道，miR-92a 在宮頸癌中表達上調，其通過下調磷脂酰肌醇-3 激酶調節亞基1 促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結果顯示，乳腺癌組織中miR-92a 表達與臨床分期和淋巴結轉移有關，其機制可能與miR-92a 能靶向抑制BTG2。BTG2是BTG/TOB 基因家族一員，作為腫瘤抑制因子參與癌細胞多種生物學行為，能通過調節哺乳動物雷帕霉素靶標、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 等信號通路抑制乳腺癌細胞發生、發展[16]。HUANG 等[17]研究報道，miR-92a 能靶向抑制BTG2 表達促進乳腺癌細胞增殖和轉移。本研究結果顯示，與低miR-92a mRNA 表達患者比較，高miR-92a mRNA 表達患者生存率顯著降低，多因素Cox 回歸也顯示，miR-92a mRNA 相對表達量≥1.627患者死亡風險增加3.401 倍，說明miR-92a mRNA表達上調與乳腺癌患者預后不良密切相關，可能成為評估乳腺癌預后的標志物。

鋅指蛋白是人體最大的轉錄家族，其促癌或抑癌作用參與惡性腫瘤發生、發展[18]。KLF4 是一種含鋅指修飾結構的蛋白，可通過結合CACCC 元件和其他DNA 序列調節基因表達，由于KLF4 具備轉錄抑制和激活2 種結構域，因此可以正向或負向調節下游靶基因，在腫瘤進展過程中發揮促癌或抑癌作用。如KLF4 mRNA 在胰腺癌中表達下調，上調KLF4 mRNA 表達能抑制胰腺癌細胞生長和轉移[19]。但在非霍奇金淋巴瘤中，KLF4 mRNA 表達上調與非霍奇金淋巴瘤細胞化療抗性、遷移和生存率降低密切相關[20]。本研究結果顯示，乳腺癌組織中KLF4 表達與臨床分期和淋巴結轉移有關，說明KLF4 表達升高與乳腺癌惡性進展有關，其機制可能與KLF4 能通過維持腫瘤干細胞樣特性有關。腫瘤干細胞具備自我復制和多細胞分化等能力，是促進腫瘤轉移、復發的腫瘤細胞。目前研究認為，KLF4 的抑癌作用主要與KLF4 能抑制上皮-間質轉化有關，而促癌作用與其能通過維持正常干細胞與腫瘤干細胞的端粒酶活性，進而維持腫瘤干細胞樣特性有關[21-22]。近年多項研究也顯示，抑制KLF4 表達能抑制乳腺癌細胞干細胞特征，增強藥物治療作用[23-24]。本研究結果顯示，與低KLF4 mRNA 表達患者比較，高KLF4 mRNA 表達患者生存率顯著降低，多因素Cox 回歸也顯示，KLF4 mRNA 相對表達量≥2.270 患者死亡風險增加2.059倍，說明KLF4 mRNA 表達上調與乳腺癌患者預后不良密切相關，也可能成為評估乳腺癌預后的標志物。本研究結果還顯示，乳腺癌組織中miR-92a與KLF4 mRNA 表達呈正相關，說明miR-92a 與KLF4 共同參與了乳腺癌惡性進展，可能與KLF4 為miR-92a 的下游調控靶點有關。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-92a、KLF4 mRNA 高表達，與臨床分期、有無淋巴結轉移有關。但本研究樣本量較少，未從細胞學上分析miR-92a，KLF4 對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，還有待進一步研究。