MicroRNA早期診斷子宮內膜異位癥的研究進展*

陳渝，夏曉夢

（中南大學湘雅二醫院，湖南長沙410011）

子宮內膜異位癥（endometriosis， EMT）是一種以子宮腔外存在子宮內膜（覆蓋子宮腔的黏膜）樣組織為特征的疾病[1]。其能夠引起慢性炎癥反應，導致盆腔內或其他部位形成瘢痕樣組織[2]。最新研究統計，EMT 影響著全球大約10%的育齡女性[3]。該病為慢性疾病，常伴有嚴重的痛經、性交痛、排便痛、排尿痛和慢性盆腔疼痛等臨床癥狀，嚴重降低了患者生活質量[4]。EMT 的癥狀多樣、發病部位廣泛，很多患者對病情的認知也十分有限，往往在臨床癥狀出現較長時間后才做出診斷。目前，EMT 尚無有效的治愈方法，治療手段通常旨在去除病灶，控制癥狀[5]。因此，EMT 的早期診斷對疾病的后續治療非常關鍵。

診斷EMT 的金標準為探查性腹腔鏡，這是一種侵入性檢查方法[6]。因此，找到非侵入性或無創的診斷方法，實現EMT 的早期診斷非常必要。學者們逐漸認識到非編碼RNA 分子在人類健康和疾病病理生理過程中發揮關鍵作用。在這些非編碼RNA 中，MicroRNA（miRNA）是真核生物中廣泛存在的一種由21～23 個核苷酸組成的RNA 分子，可調節其他基因表達[7]。miRNA 從DNA 轉錄而來，但無法進一步翻譯成蛋白質。miRNA 通過與目標mRNA 結合，進而抑制轉錄后的基因表達，在調控基因表達和細胞周期方面起著重要作用。miRNA被認為是一種廣泛的轉錄后調節分子[8]。每個單獨的miRNA 分子都可能影響細胞途徑中的多種mRNA靶點，目前已經有超過2 600 個成熟的miRNA 被研究[9]。大多數細胞和體液中都發現了miRNA，其具有意想不到的高穩定性。健康人群與患者循環中的miRNA 表達譜有明顯差異。在各種疾病如腫瘤、炎癥、心血管疾病、代謝和生殖系統疾病中，都觀察到特定的miRNA 表達水平差異[10]。目前，miRNA 被提議作為臨床診斷工具，用于識別和監測各種惡性腫瘤，并有可能為其他疾病提供無創診斷。在女性生殖系統疾病中，如婦科惡性腫瘤（如宮頸癌、卵巢癌和子宮內膜癌）、妊娠期相關疾病（如先兆子癇、早產等）、子宮肌瘤及EMT，都已經發現了miRNA 表達失調[11-13]。

1 早期診斷EMT的困境

根據病變部位的不同，EMT 主要分為4 種病理類型：淺表型、卵巢型、深部浸潤型及其他部位EMT，其臨床癥狀多種多樣，且隨著病灶對盆腔、卵巢、輸卵管或子宮的作用還會導致不孕。此外，子宮內膜異位病變的程度與癥狀的嚴重性或持續時間幾乎沒有相關性。一些病灶明顯的患者，癥狀反而較輕；而病灶很小的患者，卻可能出現嚴重癥狀[14]。通常EMT 引起的疼痛會在絕經后得到改善，但在某些情況下，慢性疼痛在絕經后仍長時間持續存在。對患者和醫生來說，EMT 最大的挑戰之一是早期診斷。據報道，EMT 確診時間一般延遲6～12年[15]，這種延遲是由社會和臨床因素造成的。例如，患者即使出現EMT 的癥狀，考慮到隱私問題，往往推遲就醫。目前25%～50%不孕癥由EMT 引起[16]，一些女性盡管已經有多年的慢性盆腔疼痛和不適，但是只有在妊娠失敗時，才首次確診為EMT。因為EMT 的癥狀可能是非特異性，可以與其他盆腔疾病重疊，對臨床醫生鑒別診斷經驗要求更高。值得注意的是，由于臨床專業知識，以及適合篩查、簡便的無創性診斷方法缺乏，在貧困及醫療條件較差的地區，EMT 的診斷時間往往會更長。

在腹腔鏡檢查明確診斷前，臨床醫生會根據患者癥狀進行經驗性治療。EMT 的一線藥物包括非甾體抗炎藥，口服避孕藥、地諾孕素、促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone agonist， GnRH-a）[17]。然而，這些藥物都不能根除EMT，服藥期間還會產生一定的副作用。當治療停止后，EMT 相關癥狀還會重現，即使進行手術，EMT 復發也很常見，50%患者在5年后需要再次手術[18]。

2 miRNA在EMT中的生物學作用

miRNA 可以通過抑制翻譯或刺激mRNA 降解來下調基因表達。在某些情況下，miRNA 還可以上調靶基因的表達。miRNA 影響從發育到致癌的多種細胞途徑。miRNA 參與多種人類疾病，使其成為潛在的診斷和預后生物標志物。與腫瘤轉移類似，異位子宮內膜具有黏附、增殖及浸潤細胞外基質的能力。EMT 是一種多因素和多基因疾病，其病理機制涉及血管生成和蛋白水解，miRNA 表達失調可能與這些過程有關。在子宮內膜基質細胞（endometrial stromal cell， ESC）和上皮細胞中，LOGAN 等[19]發現與正常樣本比較，異位ESC 和上皮細胞有9 個和16 個差異表達的miRNA。有研究發現，與EMT 有關的mRNA 靶點是血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A， VEGFA），其受5 種miRNA 的調節。這些信號蛋白能夠刺激血管生成，并參與EMT 病灶的血管生成[20]。不同部位病灶中VEGF-A 表達水平有區別，腹膜和直腸陰道結節中表達水平比卵巢高，表明前者血管生成更為活躍。VEGF 受體拮抗劑和其他抗血管生成藥物是治療EMT 的藥物[21]。動物模型證明，抗血管生成藥物可抑制異位內膜的生長，減少或縮小異位病灶的數量和體積。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）也被證實為EMT 相關的miRNA 靶點，而且組織金屬蛋白酶抑制劑也受miRNA 的調節[22]。這些蛋白水解酶降解細胞外基質，有助于組織重塑和異位內膜侵入腹膜。對分離培養的ESC 進行mRNA 的表達分析，發現在EMT 患者中有幾個相同的mRNA 靶點被改變，即ZEB1、MMP-7 和TGF-β1[19]，后者參與了EMT 上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）過程。總之，細胞增殖、血管生成、細胞外基質重塑、炎癥信號傳導及激素調節等過程在EMT 失調的miRNA 功能研究中均有涉及。

3 子宮內膜組織中的miRNA表達差異

miRNA 的全局分析方法可以用來比較組織間所有miRNA 的表達。EMT 中最常見的是比較同一患者的在位內膜與異位內膜miRNA 的表達差異，但也有研究將異位內膜與健康人群子宮內膜進行對照分析。通常通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRTPCR）等技術確認候選miRNA 的表達差異，不過即使miRNA 表達差異微小也可能產生不同的生物學的效應。WEI 等[23]對2007年—2013年發表的12 項miRNA 表達譜研究進行了薈萃分析，發現了134 個不同調控功能的miRNA。雖然個例通常只說明實驗中的一組上調或下調的miRNA，但在多個研究中發現的miRNA 分子的數量正在增加，并逐步形成miRNA 調控網絡。miRNA 在EMT 中的表達研究結果發現，卵巢異位內膜和在位內膜活檢樣本中miR-200b 的關注度最高[24]。其他有關miR-200 家族的研究也表明，miR-200 在EMT 發病機制中起著關鍵調控作用[25]。還有一些研究報道miRNA 在子宮內膜病灶中上調或下調，如miR-1、miR-29c、miR-34c、 miR-100、 miR-141、 miR-145、 miR-183、 miR-196b、 miR-200a、 miR-200b、 miR-200c、 miR-202、 miR-365 和miR-375[26]。 ZHAO等[27]通過高通量測序技術在8 例EMT 患者中確定了異位子宮內膜與在位子宮內膜中miRNA 的差異，鑒定出107 個差異表達的miRNA 和6 112 個差異表達的mRNA，并確定了一些參與EMT 發病的關鍵miRNA。RAJA 等[28]總結發現，EMT 病灶中一系列功能失調的miRNA-126、miRNA-210、miRNA-21、miRNA-199a-5p 和miRNA-20A 參與了血管生成、細胞增殖、細胞黏附和侵襲，以及EMT 過程。

為了探究miRNA 調控細胞的機制，研究者使用生物信息學工具識別每個miRNA 序列的靶標，并將這些目標基因的功能映射到細胞途徑中[23，29]。WEI 等[23]使用4 種miRNA 靶點預測工具（TargetScan、PicTar、miRanda 和miRDB），對幾項研究中一致發現的miRNA 進行預測，然后通過GeneCodis 網絡工具預測這些基因參與的生物過程和途徑。該研究分析出9 882 個有關的miRNA 靶基因，通過KEGG和Panther 路徑富集分析，得出了主要的EMT 相關路徑、內吞作用、Wnt 信號通路和血管生成靶基因[23]。QI 等[29]用Ingenuity Pathway Analysis 和Gene Ontology 等生物信息學軟件分析了EMT 中差異表達的miRNA，共鑒定了17 個顯著差異表達的miRNA和4 343 個參與EMT 的潛在miRNA。這些生物信息學分析為細胞培養的功能研究的實驗設計提供信息，并能幫助EMT 患者確定新的治療方法。

4 循環miRNA譜系研究

細胞外miRNA 可以從大多數體液中分離出來。miRNA 參與體內細胞與組織的壓力信號傳遞和交流。細胞外miRNA 要么被動釋放，要么通過外泌體或微囊泡主動從細胞中分泌出來，并與脂蛋白或RNA 結合蛋白結合。這些脂質和蛋白質復合物可以保護miRNA 不被內源性RNAs 降解[30]。循環miRNA 可能介導異位內膜的基因表達改變，也可能通過介導異位內膜與周圍組織的交流來影響EMT 的發展。最新研究顯示，循環miRNA，如Let-7 家族的miRNA，與EMT 的炎癥信號改變之間存在關聯[31-32]。為進一步探索EMT 中循環miRNA 潛在的作用，迄今已報道6 項有關EMT 患者與不同對照組的血液樣本全局基因表達譜分析結果；其中3 項研究采用血清miRNA 微陣列，2 項研究采用血漿miRNA 微陣列，另外1 項采用深度測序方法檢測血清miRNA 的差異表達[33]。除了分析來自不同血清與血漿的miRNA，miRNA 表達檢測在實驗設計上有巨大差異，使這些研究結果的比較變得復雜。這些差異包括miRNA 分析方法、受試者遺傳背景、EMT 所處的臨床階段、EMT 病理類型，以及對照組的設置。由于miRNA 在細胞中有許多靶點，而一個特定的mRNA 轉錄會受到各種miRNA 的調控，同一途徑可能受到不同的miRNA 的調控，所以沒有檢測到一個特定的分子并不排除其參與EMT 的進展。Solexa測序技術研究報告失調miRNA有108個候選miRNA，不過這些結果與其他報告的血清結果有大量重疊[34]。也有研究對EMT 患者腹腔液中的miRNA、細胞因子及其他蛋白質進行分析，確定了126 個不同表達的miRNA，其中6 個通過qRTPCR 驗證。跨獨立數據集的表達水平變化的交叉驗證結果表明，這6 個miRNA 與EMT 關系密切[35]。因此推測，這些在血液和子宮內膜組織中表達改變的miRNA 有可能作為早期診斷EMT 的生物標志物。

5 循環miRNA可作為潛在的早期診斷EMT的生物標志物

研究發現有5 個miRNA 經過多次篩選被確定有異常表達，體外實驗也證明了其在EMT 中的作用[33-35]。目前，miR-125b、miR-451 和Let-7 家族被認為最適合作為EMT 潛在的循環生物標志物，而miR-199a 和miR-145 也有作為早期診斷EMT 的生物標志物的潛力。

5.1 miR-125b

在EMT 中，miRNA 的一個主要功能是參與炎癥反應。Let-7b 和miR-125b 均能調節炎癥細胞因子信號，影響TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達水平，這些因子在EMT 患者血液中明顯增加。一項前瞻性研究結果顯示，IL-1β 升高與EMT 患病風險增加有關；IL-6 在EMT 相關的巨噬細胞中高度表達，影響了EMT 進展時的細胞遷移。伴隨著Let-7 與miRNA-125b 在炎癥信號傳導中的互補作用，這些miRNA 也因其在21 號染色體長臂（21q21.1）上的基因組位置而聚在一起[36]。Let-7、miR-125b 及miR-200 都參與了癌癥進展，其中miR-125b 可以調控細胞凋亡和增殖。MOUSTAFA 等[37]使用miRNA 測試板作為檢測EMT 的非侵入性診斷方法，發現miR-125b 在EMT 受試者血清中表達水平顯著升高。據報道，在GnRH-a（醋酸亮丙瑞林）治療后，EMT 中miR-125b 轉錄發生改變，表明其有可能成為監測療效的生物標志物[38]。

5.2 miR-145

CHENG 等[39]選擇47 例EMT 患者，miR-145 的表達水平高于對照，并且在非妊娠患者子宮內膜組織中的表達水平顯著高于妊娠患者，其研究表明miR-145 表達上調可能在EMT 不孕癥患者中發揮重要作用。YANG 等[40]報道與在位內膜比較，同一患者的異位內膜miR-145-5p 表達水平更高，該過程伴隨VEGF-A 上調和EGFR2、PTEN 和CXCR4 水平下降。有研究發現，Ⅰ/Ⅱ期EMT 患者的miR-145水平明顯高于Ⅲ/Ⅳ期。陶中娥等[41]通過對122 例EMT 合并不孕患者的研究發現，術前miR-145 表達水平對術后妊娠結局有一定的臨床預測價值。BASHTI 等[42]收集了55 例EMT 患者，結果發現miR-145 在Ⅰ/Ⅱ期EMT 患者中過度表達。

5.3 Let-7家族

Let-7 是第一個被發現的人類miRNA。Let-7 家族的miRNA 由8 個相關序列（Let7a-i）組成，已知其參與人類和其他動物的早期發育事件。Let-7 調控細胞分化的許多基本過程，并能抑制細胞的重新編程。由于對Ras 家族致癌基因的負向調控，其被歸類為腫瘤抑制因子，許多惡性腫瘤中都出現let-7 miRNA 家族表達下調。最近在EMT 患者中觀察到KRAS 的激活，并與EMT 發病和孕酮抵抗有關[31]。黃俊花等[43]分析文獻后也發現EMT 患者血清Let-7表達降低可作為臨床診斷標志物。從切除的EMT樣本中獲取總RNA，分析發現EMT 患者與正常對照組的Let-7 表達存在顯著差異，表明Let-7 具有最佳的參數（敏感性、特異性、陽性和陰性結果的預測值），可用于EMT 的早期診斷[44]。

5.4 miR-199a

與miR-145 相似，miR-199a 過度表達降低了ESC 的黏附性、遷移性和侵襲性。目前學術界提出了一種機制，即在EMT 組織中下調這種miRNA，通過抑制PAK4、IKK/NF-κB 途徑和下調IL-8 來減弱細胞侵襲性。ZHU 等[45]研究發現，miR-199a 在人子宮內膜異位囊腫基質細胞中的表達減弱，進一步使用Transwell 實驗、體外傷口愈合試驗評估轉染miR-199a 對ESC 遷移、侵襲和收縮性的影響，結果表明miR-199a 通過抑制PAK4 mRNA 表達來抑制ESC 的遷移和侵襲，miR-199a 可能在EMT 中發揮腫瘤抑制因子的作用[45]。也有學者發現，在來自卵巢的en-MSCs 中加入合成類固醇激素時，miR-199a表達上調，表明miR-199a 的作用與達那唑藥物相似，即破壞雌激素的信號傳導并抑制EMT 進程；進一步研究顯示，在缺氧條件下，miR-199a 能抑制ESC 中VEGF-A 和缺氧誘導因子1α，并減少血管生成[35]。在另一份報告中也發現，中、重度EMT患者血清miR-199a 表達水平高于輕癥患者。袁琳等[46]研究發現EMT 患者血清miR-199a 表達顯著升高，提示miR-199a 具有成為診斷EMT 生物標志物的潛力。

5.5 miR-451

WANG 等[47]采用qRT-PCR 檢測EMT 和不孕癥患者血清、組織和細胞系中miR-451 和巨噬細胞抑制因子（macrophage migration inhibitory factor， MIF）表達水平，結果發現與健康人群相比，EMT 合并不孕癥患者組織和細胞系中miR-451 異常低，而MIF異常高；miR-451 表達水平與EMT 患者并發不孕癥呈負相關。LI 等[48]通過抑制miR-451 治療EMT 小鼠，結果發現miR-451a 抑制劑可減少EMT 病變大小，表明miR-451 抑制劑進行全身治療是一種很有前景的治療方法。采用小鼠進行研究后發現miR-451 下調是通過抑制Wnt 信號通路來實現的，表明miR-451 在輔助生殖治療中可作為判斷卵母細胞和胚胎質量的新型生物標志物[48]。GAO 等[49]研究發現，EMT 患者miR-451 表達水平低于健康對照組，并且miR-451 可誘導細胞凋亡并抑制細胞增殖。石瑾秋等[50]選取54 例EMT 患者，采用qRT-PCR 檢測發現EMT 患者血漿miR-451 水平減低，miR-451 可能通過抑制異位內膜基質細胞增殖和遷移發揮作用。

6 小結與展望

miRNA 成為EMT 循環生物標志物需要符合以下標準：①在體液（血液、唾液等）中表達穩定且具有十分明顯的表達差異；②存在于EMT 的不同亞型，并且參與支撐該病所有臨床表現的共同過程；③不受一天中取樣時間或月經周期階段性的影響；④在不同種族背景的女性中表現出一致的表達模式。因此，建立這些循環生物標志物的有效性仍舊需要從大量患者群體中獲得可重復的結果，并盡可能了解其表達與EMT 進展的關系；同時開展縱向的臨床研究，進一步分析哪些miRNA 與EMT病情進展程度最相符，哪些與療效或復發明確相關。因此，通過對與EMT 病理生理相關的miRNA進行研究，找到合適的生物標志物作為早期診斷、預測療效的工具，以指導治療仍是臨床醫生未來努力的方向。