結核分枝桿菌B frA蛋白的生物信息學分析

逄亞寧，王 聰，劉 奇，張 雷，李光華

（大理大學基礎醫學院醫學微生物與免疫學教研室，云南 大理 671000）

結核病（tuberculosis，TB）是一種由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的威脅人類健康的疾病，也是當今世界引發高死亡率的主要傳染性疾病[1，2]。在尋找新的藥物靶點、提高診斷技術、加強疫苗的保護力方面都面臨著新的挑戰[3]。鐵是結核分枝桿菌生長與代謝的所需元素。BfrA 與BfrB 作為結核分枝桿菌的鐵儲存蛋白，在維持鐵環境穩態中發揮關鍵作用，其主要是在壓力環境下，通過維持鐵的平衡進而保護結核分枝桿菌的生長。同時，二者在保護結核分枝桿菌免受氧化應激損害中也發揮了重要作用。BfrA 是結核分枝桿菌在低鐵條件下生長的重要蛋白[4]。有研究發現[5]，BfrA 蛋白對于活動性結核病具有診斷意義。本研究通過生物信息學技術對結核分枝桿菌BfrA 蛋白的結構和功能進行預測與分析，以了解其致病機制及尋找該蛋白在藥物新靶點與診斷及預防方面的潛在應用價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 資料來源 在NCBI GenBank數據庫中獲取MTB BfrA 蛋白的FASTA 形式氨基酸序列：

登錄號為NP_216392.1，其編碼基因Rv1876的Gene ID 為885767。

1.2 方法 運用NCBI的ORF Finder 在線軟件分析基因Rv1876的開放閱讀框架；通過NCBI的Blastp工具分析BfrA 蛋白與人類蛋白的同源性；采用ProtParam、ProtScale 和SOSUI 在線軟件預測該蛋白理化性質；綜合利用TargetP 和PSORT、TMHMM、SignalP 分析其在細胞中的定位與分泌情況；通過Motif Scan 預測其翻譯后修飾位點；使用SOPMA、SWISS-MODEL 在線軟件預測其二級結構和三級結構；采用BepiPred 和ABCpred 軟件綜合分析該蛋白B 細胞抗原表位；使用NetMHCII、NetMHCIIpan、NetCTL、SYFPEITHI 軟件在線預測并分析其T 細胞抗原表位；運用STRING 軟件預測其蛋白相互作用網絡。所用基因與蛋白質分析軟件見表1。

表1 所用基因與蛋白質分析軟件

2 結果

2.1 基因Rv1876 開放閱讀框架 基因Rv1876 全長480 bp，位于H37Rv 全基因組的2125340—2125819區域，起始密碼子是ATG，終止密碼子為TGA。

2.2 同源性 NCBI的Blastp 結果顯示，BfrA 蛋白與人類蛋白沒有顯著同源性，發生交叉反應的幾率較低。

2.3 理化性質 通過ProtParam 在線軟件預測，BfrA蛋白含有159 個氨基酸，分子式為C802H1276N218O259S7，總原子數為2563，相對分子質量為18340.68，理論等電點為4.50。異亮氨酸是含量最多的氨基酸，占14.5%，色氨酸含量最低，為0.6%。帶負電荷殘基數（Asp+Glu）為31，帶正電荷殘基數（Arg+Lys）為15。半衰期為30 h，脂溶性指數為95.72，總平均親水性系數為-0.455。在280 nm 波長處，如所有半胱氨酸殘基成對形成胱氨酸，則其消光系數為13 075，吸光度為0.713；如所有半胱氨酸消失，則其消光系數為12 950，吸光度為0.706。不穩定系數為35.36，提示該蛋白質屬于穩定性蛋白。

2.4 疏水性和可溶性 經ProtScale 在線軟件分析其親疏水性，親、疏水性分別用負值、正值表示，在113位氨基酸處親水性最強，得分為-2.144；在第121 位氨基酸處疏水性最強，得分為1.856；親水性氨基酸總數大于疏水性氨基酸總數，見圖1。經SOSUI 軟件進一步分析，該蛋白的疏水性平均值為-0.454 717，屬于可溶性蛋白質。

圖1 BfrA 蛋白的親疏水性預測

2.5 跨膜區域、信號肽和亞細胞定位 通過TMHMM-2.0 分析，BfrA 蛋白不存在跨膜區域（圖2）；SignalP-4.1 預測該蛋白的D 值為0.103，小于閾值0.450（圖3）；TargetP-1.1 軟件顯示BfrA 蛋白為分泌性蛋白的可能性為0.107，定位在其它位置的可能性為0.886（圖4）；PSORT 軟件分析顯示，該蛋白定位于細胞質。

圖2 BfrA 蛋白跨膜區預測

圖3 BfrA 蛋白的信號肽預測

圖4 BfrA 蛋白的亞細胞定位預測

2.6 蛋白翻譯后修飾位點 Motif Scan 在線軟件分析，該蛋白含有4 個CK2-磷酸化位點（44-47、48-51、82-85、136-139），1 個豆蔻酰化位點（104-109），3 個PKC-磷酸化位點（59-61、76-78、82-84），1 個TYR-磷酸化位點（143-149）。

2.7 二級結構和三級結構 SOPMA 軟件預測BfrA 蛋白二級結構包含α-螺旋（Hh）、β-轉角（Tt）、無規則卷曲（Cc）、β-折疊（Ee），分別占79.87%、1.89%、16.35%、1.89%，見圖5。β-轉角與無規則卷曲結構較松散，多位于蛋白質表面，是優勢抗原區段。SWISS-MODEL 在線軟件通過對BfrA 蛋白進行比較建模，構建其三級結構，預測結果見圖6。

圖5 BfrA 蛋白二級結構預測

圖6 BfrA 蛋白三級結構預測

2.8 B 細胞抗原表位 利用BepiPred 1.0 Server 和ABCpred 軟件綜合預測BfrA 蛋白的B 細胞表位，得到4 個共同的B 細胞抗原表位，見表2。

2.9 T 細胞抗原表位

2.9.1 CD4+T 細胞抗原表位 使用NetMHCII-2.3 和NetMHCIIpan-4.1 軟件，選取DRB1-0101、DRB1-0301、DRB1-0401、DRB1-0701、DRB1-1101、DRB1-1501 作為HLA 亞型代表，得到10 條共同的強結合Th 細胞抗原表位肽段，見表3。

表3 CD4+T 細胞抗原表位分析結果

2.9.2 CD8+T 細胞抗原表位預測結果 結合NetCTL-1.2 和SYFPEITHI 對BfrA 蛋白的HLA-A2 與HLAA3 限制性CTL 抗原表位的預測結果，得到5 個共同優勢抗原表位（臨界值為21），見表4。

表4 CD8+T 細胞抗原表位分析結果

2.10 蛋白相互作用網絡 采用STRING 預測與BfrA相互作用的蛋白質，顯示其與hemZ、mmcO、Rv1877、bfrB 等蛋白形成相互作用網絡，見圖7。

圖7 蛋白相互作用網絡預測

3 討論

結核病耐藥菌株的廣泛蔓延以及結核病與艾滋病的相互作用，給結核病的防控工作帶來了嚴峻的考驗[6，7]。卡介苗是目前唯一可用作預防結核病的疫苗，對成人的保護效果并不穩定[8]。因此，為了更好地控制結核病的流行與傳播，提高結核病的診斷技術與治療水平，需要尋找新的藥物靶點、增強診斷技術的特異性與靈敏性以及研發更具有保護效力的結核病疫苗。

生物信息學是應用計算機技術探索生命科學的相關學科，目前已被醫學領域廣泛采納與應用[9]。本研究通過生物信息學技術手段對結核分枝桿菌的BfrA 蛋白加以分析，以期尋找其在結核病的藥物靶點、免疫診斷技術和疫苗開發方面具有的潛在應用，結果發現BfrA 蛋白是一種具有親水性質的可溶性蛋白質，不具有信號肽且不屬于分泌蛋白，其位于細胞質中，與HemZ、MmcO、Rv1877、BfrB 等蛋白發生相互作用。且經生物信息學軟件綜合分析發現，BfrA蛋白具有4條可引起強烈體液免疫的B細胞表位肽段，分別為MQGDP、RAESR、KQDTT、ADEEEH。B細胞及抗體通過多種途徑參與機體抗結核菌免疫反應的調節，B 細胞可作為抗原提呈細胞影響T細胞的分化及功能，也可調節肉芽腫免疫細胞的作用，抗體介導形成的免疫復合物可調節巨噬細胞與樹突狀細胞等效應細胞的功能[10，11]。同時，經預測發現該蛋白擁有10條與MHC-Ⅱ類分子強結合的肽段，分別為LDGLPNYQRIGSLRI、DGLPNYQRIGSLRIG、GLPNYQRIGSLRIGQ、LPNYQRIGSLRIGQT、PNYQRIGSLRIGQTL、ADLAIEYDVLNRLKP、DLAIEYDVLNRLKPG、LLEKIVADEEEHIDY、LEKIVADEEEHIDYL、EKIVADEEEHIDYLE。MHC-Ⅱ類分子主要將攝取加工的抗原肽提呈給CD4+T 細胞識別[12]。經結核分枝桿菌刺激而活化的CD4+T 細胞通過分化成Th1、Th17 多種T 細胞亞群及分泌IFN-γ、IL-2、IL-17 等多種細胞因子，并在病原菌的感染過程中發揮免疫保護功能。其中CD4+Th1 細胞通過分泌IFN-γ 細胞因子介導的控制病原菌的方式是機體抗結核感染的主要保護途徑[13-16]。CD8+T 細胞在結核病的免疫保護中同樣具有潛在價值，CD8+T 細胞經MHC-Ⅰ類分子參與提呈的特異性抗原肽刺激而活化，可通過分泌穿孔素、顆粒酶、細胞溶素等活性物質或者Fas-FasL途徑裂解靶細胞、誘導靶細胞凋亡或者直接作用于結核分枝桿菌[17-20]。同時，CD8+T 細胞也可通過分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α 參與抗結核保護[21-24]。本研究預測到BfrA 蛋白具有5 個CD8+T 細胞優勢表位，且BfrA 與人類蛋白沒有顯著相似性，發生交叉反應的可能性極低。因此，其B 細胞表位和T 細胞表位分別引起的體液免疫與細胞免疫在快速診斷技術的建立與新型疫苗的研發方面具有指引意義[25-27]。

綜上所述，通過生物信息學技術預測到BfrA 蛋白具有多個B 細胞及T 細胞抗原表位，在結核病的預防和診斷方面具有應用前景。