骨髓增殖性腫瘤中JAK2V617F突變與Ⅰ型細胞因子受體的相關性

尹鳳雷，許衛星，李淑晨，張 薇，王 娟，馬洪玉，趙 芳，劉 靜

（滄州市中心醫院血液內一科，河北 滄州 061000）

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）是一類克隆性造血干細胞疾病[1]。在經典型MPN 中，真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）與原發性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）合稱經典型BCR-ABL陰性MPN。疾病之間可互相轉化或合并存在，由于患者血細胞過度增殖，可導致血液淤滯、粘稠度增加，成為各種心腦血管疾病的高危因素。PV、ET的早期危險因素是血栓栓塞性疾病，主要是心肌梗死和腦梗塞，其次是出血和間歇性跛行；其晚期危險因素大多是骨髓纖維化所造成的嚴重貧血和心力衰竭、巨脾、出血和反復感染而導致的死亡，部分患者最終轉化為急性白血病[2]。細胞因子受體-JAK-STAT 通路作為比較重要的一個細胞增殖信號轉導通路，通過激活這一通路，不僅可以對細胞凋亡進行抑制，還能對細胞增殖起到一定的促進作用[3]。有研究發現[4]，大部分PMF、ET 以及PV 患者中，往往存在酪氨酸激酶JAK2的獲得性點突變JAK2V617F。JAK2V617F 作為激活性的一種突變，其酪氨酸激酶活性較好，可以將下游JAK-STAT 信號傳導途徑激活[5]。研究表明[6]，在PV 等BCR/ABL 陰性MPN 患者的發生和發展中，JAK2V617F 是比較重要的一個因素，但需要注意的是，其組成性激活活性的發生與Ⅰ型細胞因子受體密切相關。本研究旨在分析MPN 中Ⅰ型細胞因子受體[血小板生成素受體（c-Mpl）、粒細胞集落刺激因子受體（GCSFR）以及促紅細胞生成素受體（EPOR）]的mRNA 表達水平及其與JAK2V617F 突變之間的關系，以期為MPN 患者的靶向治療提供有效理論基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月-2021年4月滄州市中心醫院收治的MPN 患者50 例設為MPN組，另選擇同期健康者45 例設為正常對照組和15 例慢性粒細胞白血病（CML）患者設為CML組。MPN組女22 例，男28 例；年齡30～77 歲，平均年齡（53.63±9.21）歲；疾病類型：PMF 15 例、ET 15 例、PV 20 例；病史：初治21 例，治療29 例。CML組女10 例，男5例；年齡28～76 歲，平均年齡（53.43±9.31）歲。正常對照組女20 例，男25 例；年齡27～77 歲，平均年齡（53.34±9.45）歲。三組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，患者知情同意并簽署同意書。

1.2 納入及排除標準 納入標準：①臨床資料完善；②符合CML 和MPN 臨床診斷標準，且經骨髓相關指標檢查確診；③患者意識清醒，可正常交流和溝通。排除標準：①嚴重意識障礙或精神異常者；②依從性較差者。

1.3 方法

1.3.1 儀器和試劑 選擇讀膠儀、基因測序儀、ABI prism700 熒光定量PCR 儀以及核酸蛋白紫外分析儀，引物則包括SYBR Green Real Master Mix 和逆轉錄反應體系。

1.3.2 合成引物 由北京賽百盛公司合成引物，研究基因及PCR 引物序列見表1。

表1 FQPCR 擴擴增引物序列

1.3.3 實時熒光定量PCR 按照常規方法，對新鮮肝素抗凝外周血或骨髓液進行采集，在Ficoll 液中對單個核細胞進行分離備用，然后運用TRIzol 對細胞總RNA 進行提取，電泳鑒定RNA 并定量，經逆轉錄使cDNA 合成。同時，再行實時熒光定量PCR 反應，其中SYBR 反應體系共25 μl，對反應條件進行設置，60 ℃1 min，94 ℃45 s，94 ℃5 min，循環40 個，其中熒光本底信號為PCR 反應前3～15 個循環的熒光信號，對基線進行調節，直到適宜處，其中C（t）值為基線與熒光曲線之間的交叉點。根據C（t）βactin/C（t）Gene=△C（t），對檢測基因mRNA 相對表達量進行計算，其中數值與檢測基因mRNA 表達水平呈正比。

1.3.4 半定量PCR 選擇8 μl 上述JAK2V617F 擴增產物，運用2%瓊脂糖凝膠電泳進行處理后，在紫外燈下對結果進行觀察，然后運用讀膠儀AlphaImager1200進行掃描，在83 bp 位置上，若可見條帶，則判斷為JAK2V617F 突變陽性；若沒有，則為陰性。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組JAK2V617F 突變情況 MPN組中30 例存在JAK2/V617F 點突變，占比60.00%（30/50），其中PMF 患者、ET 患者以及PV 患者的陽性率分別為53.33%（8/15）、73.33%（11/15）、55.00%（11/20）；正常對照組和CML組無JAK2V617F 突變，見圖1。

圖1 RT-PCR 檢測JAK2V617F 突變圖

2.2 三組各指標mRNA 表達水平比較CML組c-Mpl、GCSFR、EPOR的mRNA 表達水平均高于MPN組、正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；MPN組GCSFR、EPOR的mRNA 表達水平均高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；但MPN組與正常對照組c-Mpl的mRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。2.3MPN組不同病史JAK2 突變患者各項指標mRNA 表達水平比較 MPN組中JAK2V617F 突變陰性初治和JAK2V617F 突變陽性初治、JAK2 突變陰性治療和JAK2 突變陽性治療患者的c-Mpl、GCSFR以及EPOR的mRNA 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表2 三組各項指標mRNA 表達水平比較（±s）

表2 三組各項指標mRNA 表達水平比較（±s）

表3 MPN組不同病史JAK2 突變患者各項指標mRNA 表達水平比較（±s）

表3 MPN組不同病史JAK2 突變患者各項指標mRNA 表達水平比較（±s）

3 討論

細胞因子受體-JAK-STAT 通路是比較重要的一條細胞增殖信號轉導通路，通過激活這一通路，能夠對細胞增殖起到一定的促進作用，從而對細胞凋亡進行抑制[7]。細胞因子結合受體后，可對受體產生誘導作用，使寡聚體形成，并且與JAK 互相作用，激活JAK 和受體，使下游多種含特定SH2 結構域的信號分析活化，誘導二聚體形成進入核內，從而提高轉錄因子活性[8，9]。有文獻報道[10]，在一些MPN 患者中纈氨酸被苯丙氨酸代替，這一突變體作為組成性激活的一種酪氨酸激酶，在細胞因子缺乏的條件下，能夠將細胞因子受體和自身受體激活，從而將下游信號傳導通路激活。

本研究結果發現，MPN組中30 例存在JAK2V617F 點突變，占比60.00%，其中PMF 患者、ET 患者以及PV 患者的陽性率分別為53.33%（8/15）、73.33%（11/15）、55.00%（11/20），但是正常對照組和CML組無JAK2V617F 突變，這一結果與田輝云等[11]、Mullally A 等[12]研究報道基本一致。通常情況下，在JAK2V617F 參與MPN 發病中Ⅰ型細胞因子受體發揮著極其重要的作用，二者只有相互作用，才能增強組成性激活活性，若JAK2V617F 脫離Ⅰ型細胞因子受體后，其生物活性則得不到有效發揮[13，14]。同時，細胞表面Ⅰ型因子受體如c-Mpl、GCSFR 以及EPOR 等，作為一種同源二聚體，當細胞因子結合其受體后，可使JAK2的二聚體形成，并且互相磷酸化，然后增強STAT5的轉錄因子活性，從而導致造血細胞的分化、增殖以及生成[15，16]。若細胞因子/細胞因子受體缺乏，則會導致造血細胞凋亡[17，18]。過表達細胞因子能夠使JAK2V617F組成激活作用增強，提示JAK2V617F 需要細胞因子受體作為橋梁，并且在信號傳導與激活中發揮著極其重要的作用。此外，本研究結果顯示，CML組c-Mpl、GCSFR、EPOR的mRNA 表達水平均高于MPN組、正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；MPN組GCSFR、EPOR的mRNA 表達水平均高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；但MPN組與正常對照組c-Mpl的mRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；MPN組中JAK2V617F 突變陰性初治和JAK2V617F突變陽性初治、JAK2 突變陰性治療和JAK2 突變陽性治療患者的c-Mpl、GCSFR 以及E POR的mRNA 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示與正常對照組比較，MPN 患者GCSFR、EPOR的mRNA 表達水平較高，但是經對癥治療后，MPN組中JAK2V617F 突變陽性治療患者的GCSFR、EPOR表達水平下降，這一結果與王曉培等[19]研究報道一致，提示其與JAK2V617F 是否突變無關。

綜上所述，JAK2V617F 或Ⅰ型細胞因子參與MPN的發展，并且在多種造血系統腫瘤疾病中Ⅰ型細胞因子的表達水平較高，但其并不是決定MPN 發病的唯一因素。