Fe3O4@C納米顆粒的界面改性及藥物輸運性能研究*

曾穎怡，龍 華，衛國英，吳 瓊

(中國計量大學 材料與化學學院，杭州 310018)

0 引 言

靶向治療是一種新型的腫瘤精準治療方法，可通過磁性載體將藥物輸運到病灶區并釋放，有針對性殺死癌細胞。因此，磁性納米載體的結構控制及其藥物輸運性能是靶向治療中的關鍵因素[1-5]。

Fe3O4納米顆粒具有良好的磁性能，化學穩定性，生物相容性以及易于加工和修飾等優點，成為一種優異的生物醫學材料[6]。Fe3O4納米顆粒在室溫下具有較強的鐵磁性和電導率，其尺寸在低于一定的臨界值時(約為20 nm)，具有特殊的超順磁性能[7]。以上特性使得Fe3O4納米顆粒可以廣泛應用于各種生物醫學領域，如藥物傳遞[8]，磁熱療[9]，核磁共振成像和診斷[10]等等。

盡管Fe3O4納米顆粒有著優異的物理化學性能，但是如何提高其穩定性以及減少顆粒的團聚現象仍是現今重要的研究課題[11]。單獨的Fe3O4納米顆粒由于納米尺寸效應極易團聚和載藥量有限，限制了其在靶向給藥方面的應用。為解決團聚現象通常需要對Fe3O4納米顆粒進行表面修飾[12]，提高Fe3O4納米顆粒的穩定性和分散性[13-15]，但同時要考慮對其磁性的影響及提高載藥量和生物相容性。

為了降低Fe3O4納米顆粒的團聚現象，提高其載藥量，本文通過水解反應包覆SiO2層，再通過水熱反應包覆碳層，最后刻蝕掉SiO2，形成了一種Fe3O4@C核殼結構納米材料。期望這種優化后的核殼結構相比于普通的核殼結構可以降低對Fe3O4納米顆粒磁性能的影響，提高復合材料的藥物負載性能，探究其作為藥物載體的性能。

1 實 驗

1.1 原材料

氯化鐵(FeCl3·6H2O，AR)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、正硅酸四乙酯(C8H12O8Si/TEOS)、氨水(NH3·H2O)、乙二醇(C2H6O2)、無水乙醇(C2H5OH/ETOH)、葡萄糖(C6H12O6·H2O)、鹽酸阿霉素(DOX·HCl)、氯化鉀(KCl)、氫氧化鈉(NaOH)，均購于上海麥克林生化科技有限公司，純度均為AR。實驗中所使用的水均為去離子水。

1.2 樣品制備

1.2.1 Fe3O4@C納米顆粒的制備

利用溶劑熱法制備Fe3O4納米顆粒[12-13]，將0.5 mol/L FeCl3·6H2O、1 mol/L NH4HCO3溶入到30 mL乙二醇中形成反應體系在200 ℃的高壓反應釜里反應12 h制成Fe3O4納米顆粒。取以上制備好的0.1 g Fe3O4和1 mol/L C6H12O6·H2O、0.2 mol/L KCl添加到30 mL去離子水中形成反應體系在140 ℃的高壓反應釜里反應制成，反應6、12 h制成包覆不同厚度C層的Fe3O4@C納米顆粒。

1.2.2 Fe3O4@C納米顆粒的界面改性

Fe3O4@C納米顆粒界面改性通過正硅酸乙酯(TEOS)水解反應在Fe3O4表面包覆SiO2層，接著通過水熱反應包覆碳層，最后利用NaOH刻蝕掉SiO2，形成了一種Fe3O4@C核殼結構納米材料。將0.1 g 制備好的Fe3O4顆粒加入到1 mmol正硅酸四乙酯(TEOS)、80 mL C2H5OH(無水乙醇)、1 mL NH3·H2O、19 mL去離子水的混合溶液中包覆C層制備Fe3O4@SiO2@C，用NaOH刻蝕Fe3O4@SiO2@C得到Fe3O4@C。通過控制TEOS的添加量和包覆C層時間制成6種Fe3O4@C， 分別為TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h、TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h、TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h、TEOS 10 mmol/L，C層包覆12 h、TEOS 15 mmol/L，C層包覆12 h、TEOS 20 mmol/L，C層包覆12 h的Fe3O4@C納米顆粒。

1.3 細胞毒性實驗

接種細胞：用含10%胎牛血清的培養基配成單個細胞懸液，血球計數板計數，以每孔4 000～10 000個細胞接種到96孔板；將培養板放在培養箱預培養15 h；加入不同濃度的顆粒(50，100，200，500，1 000和2 000 μg· mL)；處理一段時間后，吸取孔內含有藥物的培養基，加入100 μL CCK-8試劑(CCK-8稀釋比例為V(CCK-8)∶V(培養基)=10∶90)；在酶標儀上測定各孔450 nm處吸光度。

1.4 藥物負載和釋放實驗

量取25 mL去離子水，溶解1 mg鹽酸阿霉素(DOX·HCl)，稱量60 mg待測試顆粒，加入DOX·HCl溶液中，混合均勻。將上述混合液放入27 ℃的恒溫油浴鍋中，機械攪拌24 h后，在60 ℃的烘箱中烘干6 h，上層清液封裝儲存，待測試。利用朗伯-比爾定律公式計算不同類型的Fe3O4@C吸附后溶液中DOX·HCl的濃度。

根據式(1)計算藥物負載率：

藥物負載率(%) = (1-Cf/Ct)×100%

(1)

式中，Cf為游離在溶液中藥物的量；Ct為投放的藥物總量。

在不同pH值(5.0和7.4)條件下測試藥物釋放情況，通過比爾-朗伯公式計算出溶液中釋放的藥物濃度，進而可得釋放的藥物質量。

1.5 樣品表征

采用透射電子顯微鏡(FEI Tecnai F20)對Fe3O4@C納米顆粒的形貌進行分析；通過紅外光譜分析(FTIR)對復合界面結構改性后Fe3O4@C磁性納米復合材料的官能團進行表征；通過BET方法計算材料的比表面積，通過BJH模型探究材料的孔徑分布以及紫外-可見光吸收光譜分析(UV-Vis)對 Fe3O4@C納米顆粒的藥物負載率、釋放能力進行測試。使用磁性綜合物理性能測量系統(PPMS，Dynacool 9T)測試得到飽和磁化強度Ms，矯頑力Hc和剩余磁化強度Mr。

2 結果與討論

2.1 Fe3O4@C復合納米顆粒的界面改性及微結構

本文探究了不同正硅酸乙酯(TEOS)的添加量及不同C層包覆時間對Fe3O4@C納米顆粒的微結構及藥物輸運性能的影響。圖1為改變C層與Fe3O4界面結構條件下所制備的Fe3O4@C納米顆粒的透射電鏡結果(TEM)。圖1中黑色顆粒為Fe3O4納米顆粒，透明部分為碳球顆粒， Fe3O4@C納米顆粒均呈現出近球形狀，顆粒粒徑大小約50 nm。裸露的Fe3O4納米顆粒由于其固有的磁偶極子的相互作用極易于結塊，分散性差。相比于純的Fe3O4納米顆粒，C層包覆6 h后的Fe3O4納米顆粒通過界面改性后的分散性顯著提升(圖1(a)和(b))。同時在實驗過程中加入的TEOS量越多，顆粒團聚現象越明顯(圖1(f))，原因可能是生成的SiO2含量越多，顆粒分散性變差，導致包覆碳層時在團聚體外面包覆，最后刻蝕掉SiO2后Fe3O4顆粒團聚明顯。

圖1 Fe3O4@C復合納米顆粒界面改性后的TEM(a)TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h;(b) TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h;(c) TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h;(d) TEOS 10 mmol/L，C層包覆12 h;(e) TEOS 15 mmol/L，C層包覆12 h;(f) TEOS 20 mmol/L，C層包覆12 h(其它實驗條件見1.2樣品制備)Fig 1 TEM after interface modification of Fe3O4@C composite nanoparticles

圖2 復合界面改性的Fe3O4@C納米顆粒的紅外光譜圖(a)TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h;(b) TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h;(c) TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h;(d) TEOS 10 mmol/L，C層包覆12 h;(e) TEOS 15 mmol/L，C層包覆12 h;(f) TEOS 20 mmol/L，C層包覆12 hFig 2 Infrared spectra of Fe3O4@C nanoparticles modified by the composite interface

2.2 Fe3O4@C納米顆粒的藥物輸運性能

藥物載體的輸運性能主要由顆粒的磁性能和比表面積等性能表征。核殼結構的磁性納米復合材料中磁芯的磁性能會受到殼層的影響，殼層越厚，磁芯的磁性能下降越明顯[19]。通過優化設計C層與Fe3O4顆粒的界面結構，既可以保留Fe3O4納米顆粒的磁性能，也可以提高Fe3O4納米顆粒的分散性能，增加其比表面積。我們對不同實驗條件下制備的Fe3O4@C磁性納米復合材料進行了磁滯回線測試。

圖3為不同條件下合成的Fe3O4@C納米顆粒的磁滯回線。結果表明，不同合成條件下的Fe3O4@C納米顆粒的磁滯回線剩磁和矯頑力接近為0，呈現超順磁行為，且其比飽和磁化強度受合成條件影響不大，說明界面改性處理對磁性能影響較小，主要原因在于非磁性C層的厚度較薄，不足以引起比飽和磁化強度的顯著變化。

經復合界面結構改性的Fe3O4@C納米顆粒的N2吸附-脫附等溫曲線和孔徑分布圖如4所示。根據滯后環可看出，不同條件下制備的Fe3O4@C納米顆粒均是IV型等溫線，屬于介孔顆粒。根據孔徑分布圖可以觀察出顆粒的孔徑大小和分布的均一程度，這六種顆粒的均一程度相差不大，具體的差別主要體現在孔徑的大小上。結果顯示TEOS添加量 10 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒的比表面積最大，孔徑相對較小。

圖3 界面改性的Fe3O4@C納米顆粒磁滯回線(a)TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h;(b) TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h;(c) TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h;(d) TEOS 10 mmol/L，C層包覆12 h;(e) TEOS 15 mmol/L，C層包覆12 h;(f) TEOS 20 mmol/L，C層包覆12 hFig 3 Hysteresis loops of Fe3O4@C nanoparticles modified by interface

圖4 界面改性的Fe3O4@C納米顆粒的N2吸附-脫附等溫曲線和孔徑分布圖(a)TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h;(b) TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h;(c) TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h;(d) TEOS 10 mmol/L，C層包覆12 h;(e) TEOS 15 mmol/L，C層包覆12 h;(f) TEOS 20 mmol/L，C層包覆12 hFig 4 N2 adsorption-desorption isotherm and pore size distribution of interfacial modified Fe3O4@C nanoparticles

2.3 Fe3O4@C納米顆粒的細胞毒性及藥物負載能力

圖5 (a)是TEOS添加量 10 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒的細胞增殖率，圖5(b)是TEOS添加量 10 mmol/L， C層包覆12 h的Fe3O4@C納米顆粒的細胞增值率。圖中虛線是4組空白組培養細胞的細胞增殖率的平均值，TEOS添加量 10 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒為0.154，TEOS添加量 10 mmol/L， C層包覆12 h的Fe3O4@C納米顆粒為0.157。從圖中可以看出這兩種顆粒的增值率都是大于對照組的細胞增值率的，并且隨著加入的待測物濃度增加，細胞增殖率也顯著提升，說明這種納米顆粒無細胞毒性。

圖5 (a) TEOS添加量 10 mmol/L，C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒的細胞增殖率；(b) TEOS添加量10 mmol/L，C層包覆12 h的Fe3O4@C納米顆粒的細胞增殖率(其他實驗條件見1.3細胞毒性實驗)Fig 5 (a) Cell proliferation rate of Fe3O4@C nanoparticles coated in C layer for 6 h with 10 mmol/L of TEOS;(b) the cell proliferation rate of Fe3O4@C nanoparticles coated with C layer for 12 hours after the addition of 10 mmol/L TEOS (see 1.3 cytotoxicity test for other experimental conditions)

為研究經界面改性后的Fe3O4@C藥物吸附效果，我們采用了紫外可見分光光度計對不同類型的Fe3O4@C進行測試。圖6是測試顆粒吸附藥物前后的UV-Vis，通過觀察顆粒吸附藥物前后吸光度曲線變化可以看出TEOS 10 mmol/L， C層包覆6 h、TEOS 15 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒的吸附效果較好，經過模擬室溫下24 h的吸附后， 480 nm處的特征峰下降明顯，尤其是TEOS 10 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒特征峰處吸光度基本為0，表明顆粒對藥物的吸附效率接近100 %。

圖6 Fe3O4@C納米顆粒吸附藥物前后溶液的UV-Vis(a) Fe3O4納米顆粒；(b) C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒;(c) TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h;(d) TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 hFig 6 Fe3O4@C UV-Vis of solution before and after drug adsorption by nanoparticles

由藥物負載率的計算公式，可以得出改性后的Fe3O4@C納米顆粒對于DOX·HCl的吸附效果良好，負載率均在97 %以上，TEOS 15 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒的藥物負載率為97.52%，與純Fe3O4納米顆粒和Fe3O4@C納米顆粒的藥物負載率相比均有所提升。其中，效果最好的為TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒，負載率達到98.9%(圖6 (c))。

2.4 經界面改性后的Fe3O4@C納米顆粒的藥物釋放能力

正常細胞和癌細胞的細胞內外環境pH值不同[21]。血液pH值和正常細胞的內環境pH值約為7.4，而癌細胞周圍有乳酸和碳酸的積累，導致癌細胞的細胞外環境較低(5.8～7.8)[22]。基于此，本文設計了兩個pH值釋放環境，pH值=5.0和7.4。外殼層通過pH調控釋放藥物的原理是殼層表面具有弱酸性或弱堿性基團，當所處環境pH發生變化時，會使其發生溶解度的變化，或者伸縮變化，從而使藥物從介孔的孔道中釋放出來。根據對不同類型的Fe3O4@C藥物負載性能研究，我們發現TEOS 10 mmol/L， C層包覆6 h、TEOS 15/L mmol，C層包覆6 h的TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h的Fe3O4@C 3種納米顆粒對DOX·HCl的吸附效果良好，負載率最高達到98.9%，于是對這3種吸附過藥物的顆粒進行藥物釋放實驗。

在pH值為5的條件下，添加TEOS 10 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒藥物釋放率達到了81.70%。而在pH值為7.4的條件下，添加TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒藥物釋放率為65.82%。

圖7(a)是3種納米復合材料分別在pH值為5.0和pH值為7.4的環境下的釋放率與時間的曲線對比圖。隨著DOX·HCl的釋放，負載的DOX·HCl減少，PBS中的DOX·HCl增加，PBS中的DOX·HCl會抑制釋放速率。同時可以觀察出顆粒在前10 h釋放藥物最快。同一納米顆粒不同pH值環境下，顆粒在pH值為5.0時釋放率要高于pH值為7.4時的釋放率，說明該顆粒在酸性環境中藥物釋放效果更好。這主要是由于靜電相互作用有助于pH控制釋放速率，隨著pH值從7.4降至5.0，顆粒表面的zeta電位升高，這意味著表面的負電荷減少，負電荷越少意味著顆粒與DOX·HCl之間的相互作用越弱，因此DOX·HCl更傾向于在低pH值的環境中釋放[22]。值得注意的是，即使在很長一段時間后釋放緩慢，釋放也并沒有達到平穩。如果繼續投入新鮮的磷酸緩沖溶液，藥物釋放還會繼續發生。

為探究藥物釋放的動力學行為，我們根據Higuchi模型進行了線性擬合分析[23]，擬合結果見圖7 (b)，結果表明在兩種環境中第一段釋放過程均在8 h左右結束。曲線a在第一段釋放曲線中的斜率較大，是因為這段時間的釋放是由于靜電相互作用造成的。DOX·HCl在中性環境中帶正電，藥物載體表面具有大量的-OH，與DOX·HCl有較強的靜電相互作用，而在酸性環境中相互之前的作用較弱，加速了藥物的釋放。曲線b在第二段釋放過程中斜率較大，是因為第二部釋放主要是通過介孔的孔道所調節的，同種顆粒具有相同的介孔孔道，酸性環境中藥物在第一階段釋放較多，后續實驗就會更加緩慢。同時，不管在何種環境，藥物的釋放速率都會越來越慢，這是因為PBS溶液中越來越多的DOX·HCl抑制了藥物的釋放。

圖7 復合界面改性的Fe3O4@C的藥物釋放率與時間曲線與藥物載體不同pH的釋放動力學擬合曲線:曲線a為TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h(pH=5.0)；曲線b為 TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h(pH=5.0); 曲線c為 TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h(pH=5.0); 曲線d為TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h(pH=7.4); 曲線e為 TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h(pH=7.4); 曲線f為TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h(pH=7.4)Fig 7 Drug release rate and time curve of Fe3O4@C modified by composite interface and kinetics fitting curves of drug carrier release at different pHs

3 結 論

對Fe3O4@C復合納米顆粒進行了界面改性，研究表明界面改性后的顆粒分散性明顯增加，增加了顆粒的表面利用率及對藥物的負載量。

(1)合成了一系列復合界面結構改性后的Fe3O4@C磁性納米復合材料，相比于純的Fe3O4納米球，這種界面改性的顆粒分散性明顯增加。

(2)核殼結構磁性納米復合材料表面含有—OH，—CHO基團，均為親水性基團，可以作為載藥系統用于負載親水性藥物。經界面改性后的Fe3O4@C復合納米磁性顆粒呈現超順磁行為，界面改性對其磁性能影響較小。

(3)細胞毒性實驗證明該復合結構顆粒無有細胞毒性。對DOX·HCl吸附24 h之后，發現對DOX·HCl的負載率可以達到98.9 %。